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和田帝辰医药生物科技有限公司

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  • 摘要 目的:探讨肉苁蓉总苷( GCs)对阿尔茨海默病(AD)模型大鼠学习认知功能的影响及其作用机制。方法:双侧脑室注射Aβ1-42 制备AD大鼠模型,连续给予模型大鼠不同剂量的GCs 腹腔注射20 d,Morris 水迷宫检测各组大鼠空间学习记忆能力,尼氏染色观察海马CA1区细胞形态并计数正常锥体细胞;免疫组织化学测定脑组织突触素( SYN)含量、酶联免疫吸附试验测定血清超氧化物歧化酶( SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶( GSH-Px)活性、丙二醛( MDA)的含量。结果:GCs 可明显缩短逃避潜伏期与上台前路程,明显增加目标象限时间百分比与穿越平台次数;GCs 能提高海马CA1区锥体细胞的存活率,明显增加SYN蛋白的表达和提高SOD、GSH-Px 活性,降低MDA的活性。结论:GCs 改善AD学习认知障碍的机制可能是通过减少自由基堆积、清除体内过多的过氧化物,进而提高突触可塑性来改善学习认知功能。关键词 肉苁蓉总苷;阿尔茨海默病;突触可塑性;自由基;大鼠阿尔茨海默病( Alzheimer’s disease,AD)是发生在老年前期或老年期的一种慢性中枢神经系统退行性疾病;以进行性记忆减退、认知功能障碍及心理精神状态改变为主要临床表现[1] ;以大脑皮质萎缩、突触神经元丢失、老年斑( senileplaques,SP)沉积及神经原纤维缠结( neurofibrillarytangles,NFT)为主要病理改变[2],关于其发病机制目前尚不明确。肉苁蓉( cistanch)为列当科植物,药效广泛,素有“沙漠人参”之美誉。肉苁蓉总苷( glycosides of cistanche,GCs)是肉苁蓉的主要提取物,包括苯乙醇苷类、环烯醚萜类、挥发性成分、木脂素类、多糖、生物碱等。研究显示,GCs 具有改善AD相关学习认知功能障碍的药理作用[3-4] ;但关于GCs 改善学习认知的具体机制仍无定论,故研究GCs 对AD模型大鼠学习认知功能的影响,并探讨其作用机制,以期为临床治疗AD提供实验依据。1 材料和方法1.1 实验动物及分组雄性6 月龄Wistar 大鼠70 只( 购自内蒙古大学动物实验中心),饲养于清洁级环境,自由进食进水。将动物随机分为以下7 组(10 只/ 组):空白对照组( Control)、溶剂对照组( Vehicle)、假手术组( Sham)、模型组( Model)、肉苁蓉总苷低剂量组(25 mg·kg-1·d-1)、中剂量组(50 mg·kg-1·d-1)、高剂量组(100 mg·kg-1·d-1)。空白对照组不给予任何处理;假手术组只进行侧脑室插管,但无液体注射;溶剂对照组侧脑室给予与模型组等体积的灭菌水;模型组给予双侧脑室可溶性Aβ1-42 寡聚体注射( 每侧10 μg);给药组给予模型动物肉苁蓉总苷对应剂量,肉苁蓉总苷用灭菌水进行溶解,调整药液浓度,保证各组给药体积相同。动物通过灌胃给药,灌胃给药1 次/ 日,连续给药20 d。1.2 AD动物模型制备1.2.1 可溶性Aβ1-42 寡聚体的制备具体制备过程详见贾建新等[5]相关报道。将Aβ1-42粉末溶解于预冷的六氟异丙醇至浓度为1 mmol/L,而后分装到无菌微量离心管内。留取10 μL作为聚合对照。用冷冻抽干机在真空条件下将Aβ溶液抽干后-80℃保存备用。聚合过程中先将抽干后的Aβ用二甲基亚砜溶解至5 mmol/L,再用预冷的F-12/DMEM培养基稀释至200 μmol/L,4℃孵育24 h。4℃,14 000 r/min离心5 min,上清即为可溶性Aβ1-42寡聚体,将上清转移至新的EP管,4℃保存,去除离心管下方不溶的寡聚体。可溶性Aβ1-42寡聚体用前使用无菌PBS稀释至所用浓度(2 μg/μL)。1.2.2 双侧侧脑室可溶性Aβ1-42 寡聚体注射 大鼠经2 % 戊巴比妥钠(40 ~ 60 mg/kg)腹腔注射麻醉,固定于脑立体定位仪,颅顶备皮,常规碘酒消毒。至两侧眼眶之间向后沿颅骨中线切开颅顶皮肤约1 cm,钝性分离皮下组织至颅骨外膜,反复用棉球擦拭切口,防止出血。充分显露矢状缝与冠状缝,暴露前囟( bregma)。参照大鼠脑图谱[6],以前囟为始点,向后0.9 mm,中线左﹑右1.5 mm处在颅骨表面用印度墨水做标记点;用牙科电钻在标记点垂直颅骨表面进行打孔,开直径1 mm的骨窗,将微量注射器固定于脑立体定位仪的注射器夹持器上,垂直颅骨表面进针3.5 mm( 以颅骨外表面为基点)。5 min 内缓慢注入5 μL Aβ1-42(2 μg/μL),留针5 min 使其充分扩散,最后缓慢撤出注射器,对侧进行相同操作。注射完毕后,松弛注射器夹持器螺母旋钮,将动物从定位仪上撤下。手术全程动物体温维持在36℃~ 37 ℃,动物于麻醉清醒前单独放置。动物造模完成后,回笼饲养7 d 后鉴定模型制备是否成功。AD模型大鼠制备标准参照Christensen 等[7] 相关文献报道。1.2.3 蛋白标本、组织切片的存取和制备 全程实验结束后,动物腹膜腔注射常规麻醉。各组半数动物断头取脑,拨取海马冻存于超低温冰箱以备后用。半数动物剪开胸腔暴露心,将注射器针头从心尖部刺入左心室,用剪刀快速剪开右心耳;随后无菌生理盐水灌注,4 %多聚甲醛进行前固定,等待固定效果满意后终止灌注;断头开颅取脑并用4 %多聚甲醛后固定24 h。修剪大脑组织块,选取上丘平面至视交叉的节段,常规脱水、透明、石蜡包埋。石蜡组织行冠状切片,制备片厚 5 μm的组织切片用于尼氏染色和免疫组织化学显色。1.3 Morris水迷宫测试( Morris water maze test,MWM test)定位航行实验历时5 d,每天训练4 次。记录动物定位航行实验的逃避潜伏期、上台前路程及平均游泳速度。第6 天进行空间探索实验,记录动物120 s 内穿越平台的次数及在平台所在象限停留的时间百分比等指标。1.4 尼氏染色及细胞计数各组选取相同海马CA1区截面的切片进行尼氏染色。每张切片在CA1区随机选取3 个视野(200倍),计数1 mm长度内完整锥体细胞的个数,取其均数进行分析。1.5 免疫组织化学显色切片脱蜡至水,3 %过氧化氢孵育5 ~10 min, 消除内源性过氧化物酶活性, 蒸馏水洗5 min×3 次, 高压微波抗原热修复,PBS洗5 min×3 次,10 %山羊血清室温封闭30 min,滴加多克隆兔抗突触素( synaptophysin,SYN),4℃过夜,PBS洗5 min×3 次,滴加生物素标记的二抗,37 ℃ 孵育2 h,PBS洗5 min×3 次, 滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素,PBS洗5 min×3 次,DAB显色2 min,自来水洗,苏木精复染,上行梯度乙醇脱水,二甲苯透明,封片。1.6 酶联免疫吸附试验( ELISA)各组动物实验全部结束后,10 % 水合氯醛(0.35mL/100 g)溶液经腹膜腔注射麻醉。用一次性注射器从动物尾静脉抽取1 mL全血留置于EP 管中,放入冰盒。随后低温离心机4 ℃离心15 min(5 000r/min),取血清100 μL 备用。检测血清超氧化物歧化酶( superoxide dismutase,SOD) 和谷胱甘肽过氧化物酶( glutathione peroxidase,GSH-Px)活性、丙二醛( malondialdehyde,MDA) 的含量。ELISA 操作步骤根据制造商试剂盒说明书( 南京建成生物技术公司)进行。1.7 免疫印迹检测从超低温冰箱中取出冻存的脑组织,称重后放入EP管中并加入蛋白裂解液,冰浴环境下超声波破碎蛋白数次。低温超速离心机离心15 min,提取蛋白并测定蛋白浓度,将剩余的蛋白按每100 μL样品蛋白加入33.3 μL 4×上样Buffer 后振荡器混匀,置于沸水中变性10 min 备用。配制浓缩胶和分离胶,蛋白上样并进行电泳;浓缩胶恒压80 V 电泳,根据膜的面积大小计算转膜电压,恒压湿转约60 min ;5 %脱脂奶粉室温封闭1 h 后进行漂洗;SYN一抗(1 ∶ 3 000)4 ℃冰箱摇床缓慢过夜,次日取出T-TBS液漂洗;加入二抗室温避光孵育1 h 后避光漂洗;使用成像分析系统对条带进行统计分析。1.8 图像处理和统计学处理各组选取相同海马截面进行图像分析,每张切片在CA1区随机选取3个视野(200 倍) 计数1 mm长度内正常锥体细胞数,取均数分析。免疫组织化学显色结果用IPP 7.0 图像分析软件进行光密度测定。实验数据采用SPSS 18.0 软件进行分析,多样本均数比较采用单因素方差分析( one-wayANOVA),两两比较采用SNK-q 检验;多样本率的两两比较采用χ2 分割法( partitions of χ2 method)。2 结果2.1 肉苁蓉总苷对AD模型大鼠学习认知功能的作用Morris 水迷宫定位航行实验结果显示,逃避潜伏期( P<0.05)与上台前路程( P<0.05)各组间存在显著性差异。随着实验时间的增加,逃避潜伏期与上台前路程均逐渐缩短,溶剂对照组、假手术组与空白对照组相比无差异;模型组逃避潜伏期、上台前路程较空白对照组明显增加( P<0.05);低剂量组、中剂量组逃避潜伏期、上台前路程均较模型组明显缩短( P<0.05),高剂量组与模型组无差异;平均游泳速度各组之间比较差异均无统计学意义( 图1,见封三)。空间探索实验结果显示,各组在目标象限的时间百分比差异存在统计学意义( P<0.05),而假手术组、溶剂对照组与空白对照组比较无差异,模型组与空白对照组比较明显减小( P<0.05);与模型组相比,低剂量组、中剂量组在目标象限的时间百分比明显增加( P<0.05),高剂量组与模型组比较无差异。穿越平台次数组间差异存在统计学意义( P<0.05),而假手术组、溶剂对照组与空白对照组比较无差异,模型组与空白对照组比较穿越平台数明显减小( P<0.05);与模型组相比,低剂量组、中剂量组穿越平台数明显增加( P<0.05),高剂量组穿越平台数与模型组比较无差异( 图2)。2.2 肉苁蓉总苷对AD模型大鼠死亡率的影响空白对照组、溶剂对照组与假手术组、模型组、低剂量组、中剂量组给药全程结束后,动物没有出现死亡现象;而高剂量组给药过程中出现动物肠胀气、死亡现象,死亡率为30.00 %,高剂量组死亡率与其他组比较差异有统计学意义( P<0.05)。2.3 肉苁蓉总苷对AD模型大鼠海马CA1区正常锥体细胞数量的作用尼氏染色结果显示,模型组、高剂量组CA1区神经元减少,排列疏松紊乱,细胞形态大多异常、溶解坏死。低剂量组、中剂量组细胞形态规则、排列整齐、较致密,可见大量正常尼氏体,尼氏体呈紫色,核仁深染、清晰、居中,胞核不着色。空白对照组、溶剂对照组、假手术组细胞形态与低、中剂量组类似。海马CA1区锥体细胞计数显示,空白对照组、溶剂对照组、假手术组CA1区锥体细胞的数量最多,Aβ1-42 注射可以明显导致CA1区锥体细胞数量减少( P<0.05);给予模型大鼠GCs干预后,低剂量组、中剂量组CA1区锥体细胞数显著增加,与空白对照组比较无差异,而高剂量组与空白对照组比较差异有统计学意义( P<0.05)( 图3,见封三,表1)。2.4 肉苁蓉总苷对AD模型大鼠突触相关蛋白表达的作用免疫组织化学结果显示,空白对照组、溶剂对照组与假手术组海马CA1区SYN阳性细胞数较多,Aβ1-42 注射可以使大鼠海马CA1区SYN阳性细胞数减少;体外GCs 补充治疗一定程度上可以增加海马CA1区SYN阳性细胞数,低剂量组、中剂量组作用较为显著,与空白对照组比较无显著性差异,但与模型组比较差异有统计学意义( P<0.05);高剂量组与模型组比较无差异( 图4,见封三)。免疫印迹结果显示,空白对照组、溶剂对照组与假手术组海马组织SYN蛋白表达量较多,Aβ1-42 注射可以使大鼠海马组织SYN蛋白表达量减少;体外GCs 补充治疗一定程度上可以增加海马组织SYN蛋白的表达,低剂量组、中剂量组作用较为显著,与空白对照组比较无差异,但与模型组比较差异存在统计学意义( P<0.05);高剂量组与模型组比较无差异( 图5)。2.5 肉苁蓉总苷对AD模型大鼠氧化应激标志物的影响空白对照组、溶剂对照组与假手术组血清SOD、GSH-Px 活性较高,MDA活性较低;与空白对照组比较,模型组血清SOD、GSH-Px 活性明显降低,MDA活性显著升高( P<0.05);给予GCs补充治疗后,低剂量组、中剂量组可以使模型大鼠血清SOD、GSH-Px 活性显著升高,MDA活性显著降低;上述指标与空白对照组比较无差异,但与模型组比较差异存在统计学意义( P<0.05);高剂量组与模型组上述检测指标比较无差异( 表1)3 讨论AD以学习认知功能障碍为主要临床表现,其主要的病理特征是胞外Aβ 沉积形成的老年斑和胞内神经原纤维缠结。Aβ 在细胞基质沉淀聚积可引起神经元细胞毒性及神经元纤维变性[8-9]。本实验采用双侧脑室可溶性Aβ1-42 寡聚体注射制备AD大鼠模型,Morris 水迷宫实验结果显示AD模型大鼠学习认知功能显著降低,提示Aβ 对学习认知功能具有明显的损害作用,该结果与既往报道相一致[10]。在正常老化过程中,神经元间信息传递的特化结构——突触的数量及完整性出现了不同程度的下降。突触是神经信息传递的关键部位,故突触的病理改变被认为是AD学习认知功能障碍的神经生物学基础[11]。突触可塑性的降低是AD学习认知功能障碍的主要发病因素之一。既往文献报道,Aβ 可诱导突触结构异常和功能失调,进而导致突触可塑性明显下降,故Aβ 可能是引起AD学习认知功能障碍的最主要的发病因素[12-13]。研究显示,GCs 具有改善AD相关学习认知功能障碍的药理作用[3-4] ;文献报道显示,肉苁蓉提取物可以通过阻止Aβ 的沉积改善AD模型大鼠认知缺陷,并且可以提高海马多巴胺能神经元功能[14]。笔者的前期研究显示,GCs 治疗可以明显改善快速老化小鼠的学习认知功能障碍,提高树突棘的数量与突触蛋白的表达,并可以减少Aβ 的沉积,推测GCs 可能是通过阻止Aβ的沉积,进而降低对突触可塑性的损害来改善AD模型大鼠学习认知功能障碍,但GCs 通过何种机制改善突触可塑性说法不一。AD的发病机制尚未阐明,自由基堆积、细胞凋亡、突触功能的损害为目前较为公认的衰老学说[3]。既往研究证明,GCs 可以明显改善AD模型大鼠的空间学习记忆能力[3],GCs 能显著增加快速老化小鼠海马CA1区锥体细胞数量、突触蛋白SYN与PSD-95 蛋白的表达量,同时可以增加对氧化自由基的清除,故推测GCs 改善AD相关空间学习记忆能力损害可能是通过抗氧化自由基损害,清除自由基堆积,进而提高突触可塑性从而提高学习记忆能力和认知功能[15-17]。本研究结果显示GCs 可以提高海马CA1区正常锥体细胞的数量以及细胞形态,表明GCs 能显著提高细胞的存活率。此外,GCs 明显增加了海马组织树突棘的数量与SYN蛋白的表达,表明GCs提高了突触可塑性,GCs改善AD模型大鼠学习认知功能损害可能与提高突触可塑性相关。既往研究显示,GCs 具有抗氧化、抗衰老、清除自由基等功效[18-19]。龚梦鹃等[20] 用不同剂量的肉苁蓉水煎液给阳虚证的小鼠灌胃,结果显示肉苁蓉水煎液可以降低丙二醛含量,升高超氧化物歧化酶以及谷胱甘肽过氧化物酶的活性;高占友等[21]报道肉苁蓉对大鼠产生的运动性疲劳有一定的延缓作用,并且对运动造成的脑组织中氧化损伤线粒体和脂质过氧化的程度具有抑制作用。古力努尔·木特列夫等[22] 的研究表明肉苁蓉中提取的松果菊苷( ECH)能够很好地抑制体外羟自由基、超氧阴离子自由基和脂自由基,提高GSH-px 和SOD活性,降低MDA含量,抑制单胺氧化酶( MAO)活性,对D- 半乳糖所致的衰老引起的氧自由基损伤有一定的修复作用。本实验研究结果显示,GCs 可以显著提高SOD和GSH-Px 活性,相反降低MDA的活性;能够增强自由基清除酶活性,增强机体对自由基的清除活力,减少自由基对机体的损伤,防止脂质过氧化作用,保护细胞免受损伤,进而提高细胞的存活率。此外,GCs 量效实验表明, 25 ~ 50 mg • kg - 1 • d - 1 的给药剂量改善模型大鼠的学习认知功能障碍的作用最为显著,高剂量组对学习认知功能几乎无改善作用。另外,在给药过程中,高剂量组容易引起动物肠胀气、死亡等现象,笔者推测可能是药物给药剂量过大,引起的毒性反应,故理想的给药剂量应该限制在50 mg • kg - 1 • d - 1 之内。今后的实验工作仍需要继续细化给药剂量,以期获得较为准确的给药剂量,避免药物的副作用以及动物、药物的浪费。综上所述,笔者认为GCs 改善AD相关学习认知功能障碍的机制可能是通过减少自由基堆积、清除体内过多的过氧化物,进而改善突触可塑性和提高细胞存活率来实现的,这将为GCs 用于临床预防和治疗AD奠定理论和实验基础。图版说明(图见封三)图 1 肉苁蓉总苷对AD 模型大鼠学习认知功能的作用。A :逃避潜伏期;B :上台前路程。*P<0.05 vs control ;#P<0.05 vsmodel.图 3 肉苁蓉总苷对AD 模型大鼠海马CA1 区正常锥体细胞数量的作用,×200。 A :空白对照组;B :假手术组;C :溶剂对照组;D :模型组;E :低剂量组;F :中剂量组;G :高剂量组。红色箭头示海马锥体细胞发生核固缩和坏死.图 4 免疫组织化学检测各组海马CA1 区SYN 的表达,×200。A:空白对照组;B :假手术组;C :溶剂对照组;D :模型组;E :低剂量组;F :中剂量组;G :高剂量组。红色箭头示免疫组织化学显色阳性细胞.
  • 摘要: 为优化大孔树脂纯化肉苁蓉多酚提取物的工艺条件,通过静态吸附与洗脱试验筛选合适的大孔树脂型号,并研究其吸附等温与吸附动力学模型后,采取动态吸附与洗脱单因素实验确定最佳纯化工艺条件,同时进行动物的抗运动性疲劳研究。实验结果表明,HPD-400 大孔树脂的吸附等温方程符合Langmuir 模型,吸附量随温度升高而降低,且符合准二级动力学吸附过程。采用大孔树脂纯化肉苁蓉多酚提取物的最佳工艺条件为: 配制体积60 mL,6 mg /mL 上样溶液,以2 mL/min 流速上样至HPD-400 大孔树脂饱和吸附后,采用体积为180 mL,60% 乙醇溶液,以1 mL/min 流速洗脱,提取物中肉苁蓉多酚纯度由20.12%提高至42.63%。与空白对照组相比,不同剂量的肉苁蓉多酚纯化产物可显著延长小鼠游泳力竭时间( P < 0.05,P < 0.01) ,显著增加体内肝糖原、肌糖原含量与乳酸脱氢酶活力( P < 0.05,P < 0.01) ,并有极显著降低乳酸浓度水平( P < 0.01) ,因此可较好地缓解机体疲劳,从而为肉苁蓉多酚化合物的后续开发利用提供参考。关键词: 肉苁蓉,多酚,提取物,纯化,抗运动性疲劳肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉的干燥带鳞叶肉质茎,长期服用具有“补精益血”之功效,被卫计委认定为药食同源品种[1-2]。由于该植物含有多糖、多酚、生物碱、维生素及多种矿物质等营养成分,因而近年在药品和食品领域应用较多。王丽卫等[3]研究发现肉苁蓉可明显改善胃肠道的消化功能; Yang 等[4]另发现其可加强骨矿物质密度; 而王小新、陈志豪等曾分别对肉苁蓉的抗疲劳作用进行探讨,但没有研究具体活性成分的作用[5-6]。多酚化合物通常具有抗氧化、增强机体免疫及抗衰老等生理活性[7-8],而对肉苁蓉多酚提取物的纯化工艺优化和抗运动性疲劳作用的研究却鲜有报道。因此,本研究利用大孔树脂具有选择性高、干扰因素少、可重复循环利用的特点[9-11],在提取肉苁蓉多酚物质的工艺基础上,探讨大孔树脂对其纯化的最佳工艺条件,并通过相关动物实验观察其体内抗运动性疲劳的作用效果,为肉苁蓉资源的后续开发和利用提供参考。1 材料与方法1.1 材料与仪器试验动物健康雄性小鼠50 只( 动物许可证号: SYXK( 苏) 2019-0030) ,体质量10~18 g,由江苏省实验动物中心提供,生长环境温度20~25 ℃,相对湿度50% ~70%; 肉苁蓉安徽亳州药材市场,经鉴定为列当科肉苁蓉属植物肉苁蓉; 没食子酸标准品Sigma 公司; Folin - 酚试剂、无水乙醇、碳酸钠均为分析纯国药集团化学试剂有限公司; 乳酸( BLA) 、乳酸脱氢酶( LDH) 、肌糖原( MG) 和肝糖原( HG) 检测试剂盒南京建成生物工程研究所; 试验用水为去离子水。WK-40 型药材粉碎机青州迈德森制药机械厂; UV759S 型紫外- 可见分光光度计上海精密科学仪器有限公司; FA1004B 型电子天平上海越平科学仪器有限公司; NKA-2、HPD 100、HPD 300 大孔树脂北京英莱克科技发展有限公司; AB-8、HPD400 树脂合肥四峰生物科技有限公司; Lab-1A-50E 型冷冻干燥机北京博医康实验仪器有限公司;SHZ-82 型水浴恒温振荡器常州国旺仪器有限公司; 小鼠恒温游泳池上海艾研生物科技有限公司。1.2 实验方法1.2.1 多酚提取物制备将干燥后的肉苁蓉完全粉碎后,过80 目筛,准确称取20 g,加入400 mL,70%乙醇溶液,在60 ℃温度下回流提取30 min 后过滤,提取两次,合并滤液减压回收乙醇后,冷冻干燥备用[12]。1.2.2 树脂型号选择1.2.2.1 树脂预处理将大孔树脂浸泡于90%乙醇中24 h,充分溶胀后湿法装柱,后用90%乙醇反复冲洗,直至流出液与水混合( V液∶ V水= 1∶ 5) 无白色浑浊出现,再用水洗至无乙醇气味,加入3% 盐酸浸泡3 h,用水洗至中性; 再用3%氢氧化钠溶液浸泡3 h,用水洗至中性,备用[13]。1.2.2.2 静态吸附与洗脱准确称取5.0 g 六种不同极性的大孔树脂( NKA - 2、HPD 100、AB - 8、HPD300、HPD 400) 置于锥形瓶内,分别加入6 mg /mL100 mL提取液后,置于恒温振荡器内,静态吸附24 h后过滤。通过下式测得不同类型大孔树脂的静态饱和吸附量与吸附率。式中: m0为提取液中多酚质量,mg; me为饱和吸附后滤液中多酚质量,mg; m 为干燥的大孔树脂质量,g ; Γe为饱和吸附量,mg /g; Qe为饱和吸附率,%。利用乙醇作洗脱剂,将饱和吸附后的树脂置于锥形瓶内,加入60% 乙醇100 mL 后,置于恒温振荡器中,静态洗脱24 h,过滤,测定滤液中多酚的浓度,通过下式测得不同类型树脂的洗脱率与回收率。式中: m0为提取液中多酚质量,mg; me为饱和吸附后滤液中多酚质量,mg; md为洗脱液中多酚质量,mg; Dd为洗脱率,%; R 为回收率,%。1.2.3 吸附等温线准确配制100 mL 浓度为1、2、3、4、5、6、7 mg /mL 的肉苁蓉提取物溶液加入至装有5.0 g 树脂的锥形瓶后,分别置于25、35、45℃恒温摇床中,振荡吸附24 h,测得滤液总多酚浓度,计算吸附量,绘制吸附等温线,同时利用Langmuir、Freundlich 吸附模型,绘制相应等温吸附方程[14]。式中: Γm为多酚饱和吸附量,mg /g; Kb为Langmuir 方程常数; Γe为多酚吸附量,mg /g; Ce为滤液多酚浓度,mg /mL; Kf为Freundlich 方程常数。1.2.4 吸附动力学曲线准确称取大孔树脂5.0 g 置于锥形瓶内,加入100 mL 质量浓度为5 mg /mL 的多酚提取液,于25 ℃ 振荡吸附,分别于0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、7.0、10.0、12.0、16.0、20.0、24.0 h 取样,测定总多酚浓度,以吸附量( Γt) 为纵坐标,时间( t) 为横坐标,绘制静态吸附动力学曲线,分析树脂对肉苁蓉多酚的吸附动力学行为[15]。式中: K1为准一级速率常数,min - 1 ; K2为准二级速率常数,mL·mg - 1·min - 1 ; K3为颗粒内扩散速率常数,mg·min - 0. 5·min - 1。1.2.5 大孔树脂动态吸附1.2.5.1 上样液浓度影响分别准确量取等体积的多酚提取液2、4、6、8、10 mg /mL,控制流速2 mL/min,上样至预处理后的树脂内( 树脂质量: 5.0 g; 径高比:1∶ 12) ,收集柱后流出液,测得不同流出液中多酚浓度,计算各自吸附率。1.2.5.2 吸附流速影响准确量取等体积5 份1.2.5.1 确定的最佳浓度多酚提取液,分别控制流速1、2、3、4、5 mL /min,上样至预处理后的树脂内( 树脂质量: 5.0 g; 径高比: 1∶ 12) ,收集柱后流出液,测得不同流出液中多酚浓度,计算各自吸附率。1.2.5.3 树脂吸附泄露曲线准确量取1.2.5.1 确定的最佳浓度多酚提取液,以1.2.5.2 实验中确定的最佳流速上样至预处理后的树脂内( 树脂质量: 5.0 g;径高比: 1∶ 12) ,收集柱后流出液,每管体积5 mL,直至到达饱和吸附,测得各自吸附率,绘制树脂吸附泄露曲线并确定最佳上样液体积。1.2.6 大孔树脂动态洗脱1.2.6.1 乙醇浓度影响以乙醇溶液作洗脱剂,分别选择体积分数40%、50%、60%、70%、80% 的乙醇溶液,控制1 mL /min 洗脱流速,对1.2.5.3 饱和吸附后的树脂进行洗脱,直至洗脱完全,收集洗脱液,测定多酚浓度,计算各自洗脱率。1.2.6.2 洗脱流速影响配制5 份1.2.6.1 试验中确定的最佳浓度乙醇溶液,分别控制流速0.5、1、2、3、4 mL /min,对1.2.5.3 饱和吸附后的树脂进行洗脱,直至洗脱完全,收集洗脱液,测定多酚浓度,计算各自洗脱率。1.2.6.3 树脂洗脱曲线精密量取1.2.6.1 实验中确定的最佳浓度乙醇溶液,以1.2.6.2 实验中确定的最佳流速对1.2.5.3 饱和吸附后的树脂进行洗脱,直至洗脱完全,收集洗脱液,每管体积5 mL,测量每管总多酚浓度,绘制树脂洗脱曲线。1.2.7 定量分析1.2.7.1 标准曲线绘制按照文献所述方法,准确称取没食子酸标准品20 mg 溶于水中,另加入Folin-酚试剂和质量分数为20% 的NaCO3溶液,配制成质量浓度为0.1~0.8 mg /L 的标准溶液,并于760 nm 处测定吸光度[12],以浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线,得到标准曲线方程y = 1.472x-0.0527( r =0.9961) 。1.2.7.2 多酚浓度测定照上述步骤配制样品溶液后,于760 nm 波长处,测定吸光度后,根据方程计算样品中多酚浓度,另作空白试验,平行测定三次,按照下式计算样品中多酚的纯度。式中m0为样品质量,mg; C 为产物的多酚浓度,mg /mL; V 为样品体积,mL; D 为稀释倍数。1.3 体内抗疲劳研究1.3.1 模型建立将50 只健康雄性小鼠,随机分为五组,每组10 只,空白对照组采用生理盐水灌胃,其它各组则按照小鼠体重灌药,其中阳性对照组采用0.1 mg /g 西洋参灌胃,低、中、高剂量组则依次灌胃0.05、0.10、0.20 mg /g 多酚纯化物,每天灌胃1 次,连续灌胃30 d。每组小鼠灌胃1 h 后于恒温游泳池内开展游泳训练,5d 为一训练周期,共训练4 周[16]。1.3.2 动物游泳运动模型建立后,于鼠尾负重自身5%的重物,进行力竭性游泳运动,记录小鼠自入水开始游泳至沉没超过10 s 的时间,即为游泳力竭时间[17]。1.3.3 体内生化指标测定小鼠游泳运动进行10 min后,取出擦净,摘取眼球,抽血离心,同时分取肝与肌肉组织,采用相关试剂盒分别测得各组动物血清中乳酸、肝糖原、肌糖原含量和乳酸脱氢酶的活力[18]。1.4 数据处理实验结果均采用均数± 标准差表示,采用SPSS18.0 方差分析,检验水准α = 0.05,当P < 0.05 表示差异显著,P < 0.01 表示差异极显著。2 结果与讨论2.1 树脂型号确定表1 为不同型号大孔树脂对提取物中多酚的静态吸附与洗脱性能比较,从表1 中可知,不同树脂的吸附能力不同,其中HPD-400 大孔树脂对肉苁蓉多酚的吸附率最高,达到88.0%,其次为NKA-2,吸附率为77.0%,而采用60% 乙醇静态洗脱时,HPD-400 大孔树脂的洗脱率最大,达到91.2%,表明HPD-400 大孔树脂对肉苁蓉多酚的吸附与解吸性能较好,这可能源于同其它四类树脂相较,HPD-400 树脂极性适中,与多酚的相互作用较好,因此确定HPD-400 大孔树脂作为该纯化研究的吸附树脂。2.2 树脂吸附等温线HPD-400 大孔树脂对肉苁蓉多酚的吸附等温线,如图1 所示,不同温度下,随着上样液多酚浓度的增大,树脂吸附量不断增加,分别对不同温度的吸附曲线进行拟合,结果见表2 所示。从表2 可知,不同温度下HPD-400 大孔树脂对肉苁蓉多酚的等温吸附过程与Langmuir 吸附等温模型相近,方程相关系数r 均大于0.99,同时随着温度升高,吸附量逐渐减少,表明该吸附过程为放热过程。2.3 树脂吸附动力学曲线HPD-400 大孔树脂对肉苁蓉多酚的吸附动力学曲线,如图2 所示。在0~2 h 时,树脂对多酚的吸附量较大,逐渐缓慢至12 h 后达到平衡,表明HPD-400 大孔树脂对肉苁蓉多酚的吸附较快。利用相关动力学方程模型对上述吸附过程进行拟合,见表3所示,该吸附过程与准二级动力学过程更为接近,同时从Kannan 拟合方程结果可知,该吸附过程分为三个阶段,在0~4 h 为薄膜扩散过程,在4~12 h 为粒内扩散过程,Γt对t1 /2 均具有良好的线性关系,12 h 后树脂对多酚的吸附与脱附达到平衡。2.4 动态吸附条件选择2.4.1 上样液浓度选择若上样液多酚浓度过高,树脂易过早饱和,造成树脂吸附率下降,而上样液多酚浓度过低,则影响实验效率。不同上样液浓度对吸附率的影响,见图3 所示,当多酚浓度为2~6 mg /mL 时,随着上样液多酚浓度的增大,HPD-400 大孔树脂对多酚的吸附率处于较高水平,而多酚浓度大于6 mg /mL 时,吸附率开始逐渐下降,这归因于样品溶液中部分多酚的泄露,因此确定上样液最佳多酚浓度为6 mg /mL。2.4.2 吸附流速选择在动态吸附时,上样流速过快,多酚与树脂接触不充分,可能造成过早泄漏,但流速过慢,又导致纯化耗时过长,且对后续树脂再生产生不良影响。不同上样流速对吸附率的影响,见图4 所示,当上样流速在1~2 mL /min 时,HPD-400大孔树脂对多酚的吸附率无明显影响,而随着流速增大,吸附率呈下降趋势,因此选择2 mL /min 作为最佳上样流速。2.4.3 动态吸附泄漏曲线当流出液的多酚浓度为上样液浓度的10%,称为树脂吸附泄漏点,达到上样液浓度的100% 时称为树脂饱和吸附点[19]。肉苁蓉多酚在上样过程时不断被树脂吸附与脱附,当吸附速率等于脱附速率时,出现泄漏现象,见图5 所示,当上样液体积约为60 mL 时,流出液中总多酚浓度急剧上升,且超出上样液浓度10%,达到泄漏点,上样液体积约为140 mL 时,达到饱和吸附点,因此确定HPD-400 大孔树脂纯化肉苁蓉多酚化合物的最大上样体积为60 mL。2.5 洗脱条件选择2.5.1 乙醇浓度选择不同浓度的乙醇溶液对肉苁蓉多酚的洗脱效果,见图6 所示。随着洗脱液浓度增大,洗脱率逐渐增大,至60%开始下降。这可能因为低浓度乙醇破坏多酚与树脂形成的氢键能力较弱,而过高浓度乙醇的极性与多酚化合物相差较大,不利于洗脱,因此确定采用60% 乙醇溶液作为最佳洗脱液浓度。2.5.2 洗脱流速选择不同洗脱流速对肉苁蓉多酚的洗脱率影响,见图7 所示,随着洗脱流速增大,洗脱率逐渐下降,这归因于流速较快时,洗脱液不能充分接触树脂,但流速过低,又会延长洗脱过程,因此综合考虑确定1 mL /min 作为最佳洗脱流速。2.5.3 动态洗脱曲线不同洗脱液用量对肉苁蓉多酚的洗脱效果影响,见图8 所示。从图8 可知,当洗脱液体积为20 mL 时,即有多酚类化合物被洗脱流出,当用量为80 mL,洗脱液中多酚含量达到最大,随后洗脱液体积继续增大,但多酚含量不断下降。当用量约为180 mL 时,多酚类化合物基本被完全洗脱,所得洗脱曲线单一、对称、尖锐且无明显拖尾,因此确定最佳浓度的洗脱液的用量为180 mL。2.6 验证实验采取上述最佳纯化工艺,对肉苁蓉提取物中多酚类化合物,即配制体积为60 mL,多酚浓度为6 mg /mL上样液,以2 mL /min 流速,上样至HPD-400 大孔树脂饱和吸附后,采用体积为180 mL, 60%乙醇溶液,以1 mL /min 流速洗脱,测得吸附率与洗脱率分别为86.72%和90.11%,产物的总多酚纯度由纯化前( 20.12% ± 1.26%) 提高至纯化后( 42.63% ±1.69%) ,约为纯化前2.12 倍,而前人采用大孔树脂纯化苹果多酚含量由35%增高至84%,为纯化前2.4倍[20]; 黑果腺肋花楸多酚提取物经纯化后含量为纯化前5.5 倍[21],表明该工艺分离效果较好,适于肉苁蓉多酚化合物的纯化。2.7 抗疲劳作用研究2.7.1 游泳力竭时间比较负重游泳时间的长短直接反映运动过程的抗疲劳程度,不同剂量纯化产物对小鼠的负重游泳时间影响[22],见表4 所示。从表4可知,与空白对照组相较,阳性对照、低、中、高剂量组小鼠的负重游泳时间均有所延长,其中低剂量组与其差异具有显著性( P < 0.05) ,而阳性对照、中、高剂量组小鼠与其差异则极为显著( P < 0.01) ,表明肉苁蓉多酚纯化产物有助于增强小鼠的运动耐力。2.7.2 体内生化指标影响身体运动后乳酸的浓度水平与疲劳程度呈正相关,机体高强度运动后会造成体内部分细胞缺氧,致使血糖发生糖酵解生成乳酸,蓄积在骨骼肌等组织中,而乳酸脱氢酶可迅速催化乳酸脱氢形成丙酮酸,有利于排泄出体外[23]。不同剂量纯化产物对运动后小鼠的体内乳酸生化指标影响,见表5 所示。各剂量组小鼠体内的血乳酸含量和乳酸脱氢酶酶活力与空白对照组相较,差异均极为显著( P < 0.01) ,表明肉苁蓉多酚可明显提高体内乳酸脱氢酶活力,并有利于抑制体内乳酸生成。肝糖原与肌糖原则是机体的重要储能物质,当机体开始运动时,肌糖原逐渐消耗至殆尽,随后利用肝糖原以维持体内运动时血糖水平[24]。表5 为不同组别小鼠的肝糖原与肌糖原含量,与空白对照组相比,低剂量组的两种糖原含量均较高,具有显著性差异( P < 0.05) ,而阳性对照、中、高剂量组体内的两种糖原含量均明显更高,具有极显著性差异( P <0.01) ,表明肉苁蓉多酚纯化产物有助于增加体内肝糖原与肌糖原储备。3 结论采用HPD-400 大孔树脂分离纯化肉苁蓉提取物中多酚类化合物,该吸附过程符合准二级动力学方程,等温吸附线与Langmuir 模型较好拟合,且多酚吸附量伴随温度升高而减少。通过动态吸附与洗脱=试验,优选得到最佳纯化工艺条件: 配制体积为60 mL,多酚浓度为6 mg /mL 上样液,以2 mL /min 流速,上样至HPD-400 大孔树脂饱和吸附后,采用体积为180 mL,60%乙醇溶液,以1 mL /min 流速洗脱,树脂对多酚类化合物的吸附率和解吸率分别达到86.72%和90.11%。产物中总多酚含量由纯化前20.12%提高至纯化后42.63%,约为纯化前2.12 倍。该工艺操作简便、纯化效率较高,低、中、高剂量产物均可明显增强机体运动耐力,提高体内乳酸脱氢酶活力,抑制乳酸生成水平,并可增加肝糖原与肌糖原的储备,从而具有较好的抗运动性疲劳作用。参考文献[1]陈志豪,朱效兵,夏美茹,等.肉苁蓉的营养保健特性及加工应用[J].现代食品,2019( 5) : 123-126.[2]Zhang A,Yang X,Li Q,et al.Immunostimulatory activity ofwater- extractable polysaccharides from cistanchedeserticola as aplant adjuvant in vitro and in vivo[J]. 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  • 【摘要】文章对肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷闪提工艺进行了研究,分别从肉苁蓉药材中活性成分提取工艺优化,肉苁蓉多糖的分离纯化;肉苁蓉精制多糖理化性质检测,肉苁蓉药材植物图谱的建立;肉苁蓉随机扩增DNA 多态性(RAPD) 指纹图谱等几个方面进行了详细的介绍。闪式提取法提取肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的操作简单、提取率高、耗时短、节省能源, 可为松果菊苷和毛蕊花糖苷的新药开发和工业化生产提供依据,有着更好的推广价值。【关键词】肉苁蓉;松果菊苷;毛蕊花糖苷;闪提工艺;工艺研究肉苁蓉是一种化学成分十分复杂化的物质,被分类为多组分复杂体系。其自身的药材品种十分珍稀的品种,无论是贮藏、产地还是药材的加工工艺,在一定程度上有着很大的难度,是当前研究肉苁蓉药材工作人员的重点关注方向。对于肉苁蓉这一药物而言,其发挥作用是众多成分共同努力的结果,每一种化学成分都不可忽略,但是现在,这一药物的有效成分依旧是一个不明确的课题,有效成分如何发挥作用也尚未明确。因此,现在很多针对这一药物的研究往往是针对其整体或者个别化学成分进行的。相关工作人员想要有效发展中药材的前进研究,需要从质控角度下手,建立健全现代肉苁蓉的质量控制的标准体系。最为常见的肉苁蓉质量稳定性的评价方法就是指纹图谱分析技术,通过谱图反应肉苁蓉材内的化学成分种类与数量,能够提供综合信息从而较好的评价药材质量。1 实验方法1.1 肉苁蓉提取方式的选择 实验人员用天平精密称取3份干燥且粉状的肉苁蓉切片 10.0g。首先,提取100g 的纯净水,第一份粉状的肉苁蓉需要用回流法进行成分的有效提取,实际操作过程中,保证回流提取的次数为2 次,每一次的提取操作控制在2h 左右。第二份粉状的肉苁蓉则需要采用冷浸法进行成分的有效提取,然后提取之后,相关工作人员需要将其放在室温的环境下,遮挡全部的光线的同时,对其完全浸泡,浸泡的时间控制在2d[1]。第三份粉状的肉苁蓉需要采用超声法对其药材内部的成本进行有效提取,实际操作过程中选择用超声提取2 次,每次的提取时间控制在1h。然后,将已经加工处理的三分粉状的肉苁蓉,通过多糖含量测定方法的正确操作,合理的对其进行多糖含量的整体分析比较,分析比较结果,结合实际需求情况,从不同的提取方法挑选出最适合的提取方式。1.2 提取工艺考察 在实际提取工艺考察的时候,相关工作人员需要有效的取出干燥的肉苁蓉饮片,紧接着使用60℃~90℃的石油醚中进行回流提取,其中在进行回流提取的时候,需要保证石油醚的体积含量需要是干燥的肉苁蓉饮片的10 倍量体积。在回流提取的时候,需要严格控制回流提取的时长,最好控制在2h/ 次。回流提取之后,相关工作人员需要过滤掉石油醚,然后将肉苁蓉饮片进行干燥处理,紧接着用乙醇对其进行回流提取,其中在进行回流提取的时候,需要保证乙醚的体积含量需要是干燥的肉苁蓉饮片的10 倍量体积,并且乙醚的含量为80%。在回流提取的时候,需要严格控制回流提取的时长,最好控制在2h/ 次,一共进行两次,回流提取之后再对剩余的肉苁蓉药渣过滤[2]。相关工作人员将已经烘干之后的肉苁蓉药渣,再进行蒸馏水回流提取。回流提取之后,将滤液进行合并处理,将其进行旋蒸浓缩加工操作。然后,相关工作人员需要把乙醇的浓度设置为变量,选择不同的乙醚浓度浸泡烘干后的滤渣,其中在进行浸泡的时候,需要保证乙醚的体积含量需要是干燥的肉苁蓉饮片的5 倍量体积,并且存在乙醚的室内温度以及乙醚的温度为4℃。静置过夜之后,相关工作人员合理施工离心机,将沉淀的多糖有效收集。将收集到的多糖经过真空干燥后,变成肉苁蓉粗多糖。1.3 多糖的含量测定 采用苯酚- 硫酸法测定肉苁蓉多糖含量[3]。2 肉苁蓉液相指纹图谱建立的实验方法2.1 供试品溶液的制备 相关工作人员用天平精密称取干燥且粉状的肉苁蓉切片1.0g。首先,在1.0g 干燥且粉状的肉苁蓉切片中添加甲醇,甲醇的体积控制在50mL。之后用超声提取溶液,此时需要控制超声提取的时间,需要将其控制在30min 的时长,在提取过程中,相关工作人员需要及时使用甲醇溶液补重量。30min 之后,相关工作人员将提取的取续滤液5mL,将其完全蒸干之后。继续在容器中添加足量的甲醇溶液,彻底溶解之后,将溶液转移到10mL容量瓶。相关工作人员添加甲醇溶液,直到溶液高度到达容量瓶的刻度,停止添加甲醇溶液。相关工作人利用0.45µm 微孔滤膜有效滤过溶液,将溶液保存好,准备备用。2.2HPLC-UV 色谱条件 相关工作人员广泛的查阅相关文献资料,结果显示,试验可以通过色谱条件的优化、比较以及筛选,最终得到的结合可以很好的明确色谱条件:色谱柱 Kromasil(250×4.6 mm,5µm),,分析时间共设置为90min,进样量为10µl,流动相为0.5% 醋酸水(B) 以及乙腈(A) 梯度洗脱,将其流速控制在1.0mL/min,检测波长为310nm,柱温为28℃[4]。2.3 方法学考察 从精密度实验、重复性实验以及稳定性实验等对其结果进行有效验证。3 总结文章选择使用多种柱色谱联合的方式,有效实现了肉苁蓉粗多糖的分离以及纯化,与此同时,相关工作人员还用现代分析技术对其进行理化性质的测定。该实验过程与结果,为工作人员研究肉苁蓉的质量控制提供参考意义。建立肉苁蓉HPLC-DNA 指纹图谱,并进行相似度评价和聚类分析,以期为肉苁蓉的科学鉴定和质量标准提供参考依据。参考文献[1] 初侨, 席兴军, 杨丽. 肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷闪提工艺研究[J]. 食品研究与开发,2015,36(16):49-52.[2] 王茜, 王啟之, 时维静, 等. 响应面法与正交设计法优化黄蜀葵总黄酮闪提工艺比较[J]. 安徽科技学院学报,2015,29(05):24-31.[3] 周康, 刘延泽, 王中博, 等. 积雪草苷的闪提工艺优选及不同提取方法的比较研究[J]. 中国中药杂志,2011,36(23):3265-3267.[4] 董洁琼, 王意敏, 李建霞, 等. 激素诱导和非生物胁迫对虎杖根中白藜芦醇含量影响及虎杖根中白藜芦醇闪提工艺优化[J]. 食品工业科技,2016,37(21):210-215.
  • 摘 要:肉苁蓉具有较高的营养和保健功能。本文旨在分类总结肉苁蓉功能因子的提取及其测定方法,为肉苁蓉功能因子的提取、测定及相关领域的进一步研究提供参考。关键词:肉苁蓉;功能因子;提取测定方法肉苁蓉,多年生草本列当科肉苁蓉属植物,多寄生于藜科梭梭属植物的根部[1],生长于半荒漠和荒漠地区,主产于内蒙古自治区(阿拉善盟、巴彦淖尔市)、甘肃省、新疆维吾尔自治区等地。在历代中医补肾壮阳类药物中,使用肉苁蓉的频度很高,因为其功效显著,长于沙漠,被美誉为“沙漠人参”[2],2018 年被列为药食同源类植物。资料显示,肉苁蓉有益肾壮阳[3]、润肠通便[4]、护肝[5]、调节免疫力[6]、抗肿瘤、抗氧化、抗疲劳[1,7]、抗福射、保护神经系统与改善健忘等作用[8-10],遂引起了国内外众多学者的探究。本文综合有关肉苁蓉功能因子检测技术文献,旨在为肉苁蓉功能因子测定方法及提取工艺提供参考。1 肉苁蓉的功能因子从20 世纪80 年代以来,国内外学者对肉苁蓉的功能因子进行了大量的研究[11-12],并取得了极大的进展。研究者们对肉苁蓉进行了分析,从中分离得到28种苯乙醇苷类成分(见表1)[14-16];周玉碧等[17] 采用气相- 质谱联用法分析了肉苁蓉脂溶性提取物中的化学成分,共鉴定了73 种化合物。另外,文献报道肉苁蓉中还检出多糖类、黄酮类、环烯醚萜甙、木脂素类、生物碱、氨基酸与微量元素等化学成分[14,18]。2 肉苁蓉主要功能因子的提取及测定2.1 多糖类多糖是肉苁蓉的主要功能因子之一,其具有抗衰老、抗肿瘤、调节免疫力等作用[19]。连乐等[19] 研究得出肉苁蓉多糖超声波提取工艺:料水比1 ∶ 25,提取温度60 ℃,提取时间75 min,含量为18.90%。肖星辉等[20] 探究得出水浸提法提取肉苁蓉多糖:料液比1 ∶ 55,温度75 ℃,提取165 min,多糖提取率为18.40%。高建德等[21] 确定了复合酶提取肉苁蓉多糖的最佳工艺:复合酶用量0.2%,酶解温度50 ℃,酶解1.5 h。肖道安[22] 采用蒽酮- 硫酸法测定肉苁蓉多糖含量,用吐温60 协同超声提取肉苁蓉多糖:表面活性剂为0.5% 吐温60,料液比1 ∶ 25,温度60 ℃,提取时间30 min,多糖得率为8.17%。裴爱田[23] 研究得出肉苁蓉粗多糖脱蛋白工艺:蛋白酶添加量125.6 U·mL-1,酶解温度30.0 ℃,酶解时间96.1 min,pH 为5.4。肖星辉等[20] 探究肉苁蓉最适去蛋白工艺为木瓜蛋白酶用量0.2%,温度50 ℃,时间2 h,多糖的保留率可达96.00%。在肉苁蓉多糖脱色方面,裴爱田[23] 的研究结果:活性炭添加量为2.5%,温度50 ℃,吸附40 min。肖星辉等[20] 认为AB-8 大孔树脂脱色优于活性炭脱色,其工艺为:上样浓度4 g·L-1,洗脱液为60% 乙醇,流速1 mL·min-1。2.2 黄酮类肉苁蓉黄酮类物质有改善睡眠、调节机体机能、抗衰老等功效。张瑞平[24] 研究乙醇提取法提取肉苁蓉总黄酮:乙醇浓度70%、料液比1 ∶ 30、提取时间2 h、温度40 ℃,提取率为9.33%。罗岩[25] 研究超声波辅助提取法提取管花肉苁蓉中黄酮类物质:乙醇体积分数70%,料液比1 ∶ 30,提取40 min,提取2 次,测定含量为8.45 mg·mL-1。杨凯等[26] 研究表面活性剂水溶液作为提取剂提取肉苁蓉总黄酮:水溶液提取剂为0.2%的十二烷基硫酸钠,料液比(g ∶ mL)1 ∶ 20,提取温度80 ℃,提取1.0 h,肉苁蓉黄酮的提取率可达7.34%。肖星辉等[27] 研究乙醇- 盐双水相萃取法萃取肉苁蓉总黄酮的工艺:50%的乙醇,料液比1 ∶ 50(g ∶mL),提取时间3.5 h,温度90 ℃,总黄酮平均得率可达到(13.04±0.06)%; 最佳双水相分离体系为Et OHK2HPO4,分离条件为70%EtOH、0.2 g·mL-1 K2HPO4,荒漠肉苁蓉提取液体积分数14%。徐常永等[28] 通过静态吸附实验,得到AB-8 型大孔吸附树脂分离纯化肉苁蓉总黄酮的工艺条件:最佳吸附条件,上样液浓度1.5 mg·mL-1,流速3 mL·min-1,pH=6;最佳解吸附条件,80% 的乙醇以3 mL·min 的流速洗脱,使用12 倍柱床体积,分离纯化后总黄酮的质量分数为72.35%。2.3 苯乙醇苷苯乙醇苷类化合物是肉苁蓉的主要功能因子之一,其主要成分为松果菊苷和毛蕊花糖苷[29],有着补肾壮阳、保护肝脏、抗氧化与调节免疫力等作用[30]。2.3.1 苯乙醇总苷丁慧玲等[31] 优化超声- 微波回流提取肉苁蓉中苯乙醇苷工艺,得到在超声频率40 kHz,功率50 W,提取15 min 时,最优工艺条件为丙酮体积分数50%,液料比14 ∶ 1(mL ∶ g),微波功率100 W,验证实验得率与理论值接近。黄翔等[32] 研究不同干燥方式对肉苁蓉中5 种苯乙醇苷类成分的影响,得出最佳提取工艺:甲醇体积分数55.14%,液料比46.39,提取时间38.50 min。刘丽莎[33] 等研究肉苁蓉苯乙醇苷水溶媒提取最佳工艺:原料粒径>40 目,料液比1 ∶ 15,80 ℃下浸提2 h,提取率为(175.9±1.1)mg·g-1。刘朋龙等[34] 应用AB-8 型大孔树脂分离纯化肉苁蓉苯乙醇苷:上样液浓度1.2 mg·mL-1,上样流速1.5 BV·h-1,吸附时间1.5 h;解析时间4 h,体积分数40% 的乙醇洗脱,洗脱流速1.5 BV·h-1。裴文静[29] 研究了高剪切均质化提取法纯化肉苁蓉苯乙醇苷:乙醇浓度50%,提取温度70 ℃,高剪切均质乳化机转速16 000 r·min-1,高剪切均质乳化2 min,料液比1 ∶ 9,提取1 次。余逸凡等[35] 优化了大孔吸附树脂分离纯化荒漠肉苁蓉总苷的工艺条件。结果表明,D-101 为纯化的较佳树脂,上样液浓度2.0 mg·mL-1,流速2 mL·min-1;洗脱液体积6 BV 为较佳吸附条件,该条件下纯化后总苷含量为纯化前的28.85 倍。2.3.2 松果菊苷周海燕等[36] 采用HPLC 法, 以C18 为色谱柱,甲醇-0.1% 甲酸为流动相, 梯度洗脱, 体积流量1.0 mL·min-1,柱温35 ℃,检测波长330 nm,松果菊苷在0.025 5 ~ 0.612 0 mg·mL-1 范围内线性关系良好,平均回收率为100.59%。初侨等[37] 采用闪式技术提取肉苁蓉中松果菊苷:60% 乙醇,闪提转速5 500 r·min-1,提取90 s,料液比1 ∶ 30(g ∶ mL),松果菊苷的提取率为8.87 mg·g-1。王怀煦[38] 探究采用大孔树脂纯化肉苁蓉中松果菊苷的工艺:大孔树脂运用HPD100,6 BV 的50% 乙醇洗脱,气平均收率为91.4%。2.3.3 毛蕊花糖苷初侨等[37] 采用闪式技术提取肉苁蓉中毛蕊花糖苷,最佳提取工艺同初侨的松果菊苷提取工艺,毛蕊花糖苷的提取率为6.60 mg·g-1。孔征等[39] 优化提取肉苁蓉毛蕊花糖苷最优工艺为乙醇浓度63%、液料比8 ∶ 1(mL ∶ g)、浸泡2 h、提取1.5 h、提取2 次。李明国[40] 建立了肉苁蓉中毛蕊花糖苷的高效毛细管电泳测定方法:电压8 kV,运行缓冲溶液30 mmol·L-1 硼酸- 硼砂(pH=9.0),室温,检测波长334 nm。毛蕊花糖苷的浓度在0.015 ~ 0.375 mg·mL-1范围内线性关系良好,样品回收率为99.26%。孔征等[38] 测定肉苁蓉毛蕊花糖苷含量,采用高效液相色谱法:色谱柱为Inertsil-ODS-3V,甲醇-0.2% 甲酸水溶液(40 ∶ 60,V ∶ V)作为流动相,进样量10 μL,流速1 mL·min-1,柱温30 ℃,检测波长330 nm。毛蕊花糖苷检测质量浓度的线性范围为18.65 ~ 932.4 μg·mL-1。2.3.4 红景天苷李明国等[41] 建立高效毛细管电泳色谱法测定肉苁蓉中红景天苷含量的方法。采用毛细管区带电泳(CZE):运行缓冲液30 mmol·L-1 硼酸- 硼砂缓冲液(pH=9.00),电压8 kV,柱温25 ℃,波长278 nm,红景天苷含量在0.007 ~ 0.140 mg·mL-1 的浓度范围内线性关系良好[40-41]。2.4 多酚类物质张春玲[42] 研究建立了紫外- 可见分光光度法测定肉苁蓉中多酚类物质(以没食子酸计)含量的方法:70% 的乙醇、料液比为1 ∶ 20、60 ℃、提取30 min,肉苁蓉中多酚类物质的提取效果最好,平均质量百分比为0.242 2%。栾朝霞[43] 优化大孔树脂纯化肉苁蓉多酚提取物:适用HPD-400 大孔树脂,上样溶液60 mL,6 mg·mL-1,流速2 mL·min-1;采用60% 的乙醇180 mL、1 mL·min-1 流速洗脱。3 结语肉苁蓉主要功能因子的提取及测定方法较多,笔者对常用方法进行了归纳总结,选出每种测定方法的最优工艺条件供读者参考。参考文献:[1] 李予霞,茹 阳. 肉苁蓉的氨基酸含量测定及营养评价[J]. 安徽农业科学,2007(17):5054,5056.[2] 敖艳青. 肉苁蓉的研究进展[J]. 中国民族医药杂志,2013,19(3):34-36.[3] 王德俊,盛树青,梁 虹. 肉苁蓉对小鼠睾丸和附睾形态学与组织化学的影响[J]. 解剖学研究,2000,22(2):101-103.[4] 王丽卫,孙健,赵 兵,等. 肉苁蓉膳食纤维润肠通便功能研究[J]. 食品安全质量检测学报,2016,9(7):3740-3744.[5]Wu Y,Li L,Wen T,et al.Protective effectsof echinacoside on carbon tetrachloride inducedhepatotoxicity in rats[J].Toxicology,2007,232(1/2):50-56.[6] 张 涛,许文胜,贾彦斌,等. 肉苁蓉多糖对THP-1 细胞吞噬作用的影响及其机理研究[J]. 生命科学研究,2013,17(2):148-150,155.[7] 陈 华,董利森. 肉苁蓉多糖抗衰老作用的研究进展[J]. 中国煤炭工业医学杂志,2012,15(2):310-311.[8] 李琳琳,王晓雯. 肉苁蓉总苷的抗脂质过氧化作用及抗辐射作用[J]. 中国中药杂志,1997,22(6):364-367.[9] 薛德钧,章 明,吴小红,等. 肉苁蓉抗衰老活性成分的研究[J]. 中国中药杂志,1995(11):687-689,704.[ 1 0 ] P e n g X M,G a o L,H u o S X,e t a l . 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  • 肉苁蓉(Cistanche deserticola Y.C.Ma)是我国中医用途最广的珍贵中草药之一,习称大芸、苁蓉,为列当科(Orobanchanceae肉苁蓉属(Cistanche)多年生寄生草本植物,专性寄生在藜科(Chenopodiaceae) 梭梭(Haloxylon ammodendron(C.A.Mey)Bunge)和白梭梭(H.Persicum Bungeex Boiss)的根部[1]。主产于我国内蒙、新疆、甘肃、宁夏、青海等省(区)以及伊朗、蒙古、印度等国,其味甘咸微辛酸、微温。在《神农本草经》中将其列为上品,中国药典规定正品为干燥带鳞叶的肉质茎[2-5]。肉苁蓉具有强肝肾,益精血,滑肠通便之功效,动物实验显示有降压作用,其中所含儿茶素具有提高免疫功能、清除自由基、抗氧化作用、防突变、抗癌等活性,与肉苁蓉主要药理作用相吻合[6-8]。本课题经HPLC预试验发现儿茶素含量较高,但中国药典对其含量的测定方法却没有具体标准,而对肉苁蓉中儿茶素的含量测定目前尚未见有文献报道。因此,本文将对肉苁蓉中儿茶素的提取及含量测定进行条件优化及探索,希望找到一条切实可行的测定方法,为今后肉苁蓉的进一步研究开发提供依据。1 材料与仪器1.1 材料肉苁蓉产自甘肃省酒泉市瓜州县。1.2 仪器与试剂STI 型液相色谱仪(赛智科技有限公司);SHB-2V 循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);80-2 离心机(江苏大地自动化仪器厂);BSA124S 型分析天平(赛多利斯科学有限公司);KQ-500 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。儿茶素标准品购自坛墨质检标准物质中心(批号00003310-QIA);乙腈、甲醇均为色谱纯;实验用水为超纯水。2 实验方法2.1 色谱条件色谱柱:KromsstarTM 柱(4.6×250 mm,5 μm);流动相为乙腈-水(30︰70,V/V),流动:相流速为0.8 mL/min;进样量:10 μL;紫外检测波长:260 nm;柱温:25 ℃。2.2 儿茶素标准曲线的绘制准确称取105 ℃干燥至恒重的儿茶素标准品 0.0155 g(精确至0.0001 g),用甲醇溶解并定容至25 mL,配制0.602 μg/μL 的标准溶液。精密吸取1.00、2.00、4.00、6.00、8.00 mL 对照品储备液于10 mL 容量瓶中,用甲醇定容,混合均匀,得标准系列溶液。进样并测定峰面积,以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标,计算线性回归方程。2.3 样品中儿茶素的提取2.3.1 提取工艺精密称取晾干并粉碎的肉苁蓉药材2.0000 g,加入15 mL 甲醇,在40 kHz 和50 ℃条件下超声提取30 min,抽滤,滤渣再加入15 mL 甲醇重复提取3 次,抽滤,合并滤液。将滤液浓缩近干,浓缩残余物以甲醇溶解并定容至5 mL,静置过夜。测定前取出,放至室温。取上清液,过0.45 μm 滤膜后进行HPLC 分析。2.3.2 提取的单因素试验对可能影响儿茶素得率的几个因素(料液比、超声温度、提取时间、重复提取次数)分别作单因素试验,测定提取液中儿茶素的峰面积值,计算儿茶素含量[9]。2.3.3 最佳提取条件的选择以料液比、超声温度、提取时间、重复提取次数为因素,选择L9(34)正交表进行四因素三水平试验,各处理重复3 次,并进行方差分析。2.4 方法评价2.4.1 精密度检查吸取20 μL 样品溶液,重复进样6 次,样品峰面积积分值的RSD 为1.28 %,表明仪器精密度良好。2.4.2 重复性实验制备5 份样品溶液,分别吸取20 μL 进样,测定,峰面积积分值的RSD 为1.23 %。2.4.3 稳定性实验精密吸取同一样品溶液,在12 小时内按0.5 h 的时间间隔重复进样7 次,每次进样20 μL,样品中儿茶素峰面积积分值的RSD为1.94 %。2.4.4 加标回收率实验吸取已知浓度的供试品溶液0.5 mL,加入0.602 μg/μL 的儿茶素标准品溶液 0.1、0.2、0.3 mL 稀释至10 mL 混匀,分别进样20 μL 测定其峰面积积分值,求得儿茶素平均回收率为98.56 %。3 结果与讨论3.1 色谱分析结果标准品和样品提取液中儿茶素色谱图分别见图和图2。在该条件下,保留时间3.423 min 处儿茶素可有效分离。3.2 肉苁蓉中儿茶素提取的单因素试验3.2.1 料液比其它实验条件同2.3.1,按不同料比2 g︰10 mL、2 g︰15 mL、2 g︰20 mL、2 g︰25 mL 加入甲醇溶液提取,实验结果见图3。如图可知,料液比对儿茶素的提取有较大影响,最终选择2 g︰15mL 为最佳料液比。3.2.2 超声温度其它实验条件同2.3.1,按照不同的超声温度 30、40、50、60、70、80 ℃,实验结果见图4。如图可知,随着温度升高,儿茶素的提取率逐渐上升,50 ℃为最佳提取温度。3.2.3 超声时间其它实验条件同2.3.1,按照不同的超声时间10、20、30、40、50、60 min,实验结果见图5。如图可知,随着时间的增加,儿茶素的提取率有所上升,但是在30 min 以后,提取率基本保持不变,因此从节约时间成本的角度考虑选择最佳提取时间为30 min。3.2.4 提取次数参照2.3.1 方法分别提取1~4 次,合并滤液分析,实验结果见图7。3.3 正交试验在单因素试验基础上,设计料液比、提取温度、超声时间、提取次数的4 因素3 水平正交实验,因素水平见表1,正交试验结果见表2。通过正交试验和方差分析结果表明,影响肉苁蓉儿茶素提取的因素主次顺序为:A>B>D>C,即甲醇体积对儿茶素提取效果影响最大,其次为提取温度和提取次数,超声时间影响较小。综合考虑,儿茶素的最佳提取条件为:甲醇体积25 mL,提取温度60 ℃、提取次数1 次,超声时间30 min。3.4 肉苁蓉中儿茶素含量的测定采用标准物加入法对肉苁蓉中儿茶素进行定性,保留时间3.423 min 处色谱峰为儿茶素,见表1、2。通过峰面积定量法计算得到肉苁蓉中儿茶素的含量为26.77 mg/g。4 结论本文建立了高效液相色谱法测定肉苁蓉中儿茶素含量的方法,为中药肉苁蓉标准的制定提供依据。通过优化料液比、提取温度、超声时间、提取次数等实验参数,确定儿茶素的最佳提取条件为:甲醇料液比2 g︰25 mL、提取温度60 ℃、提取1 次、超声提取30 min,在此条件下,肉苁蓉中儿茶素含量为26.77mg/g。参考文献[1]谭德远,郭泉水,王春玲.我国肉苁蓉资源状况及开发利用研究[J].林业资源管理,2004,2(4):29-32.[2]赵奎君,梁丽娟,毕丹,等.HPLC-ELSD 测定肉苁蓉及管花肉苁蓉中半乳糖醇含量[J].Chinese Journal of Information on TCM,2012,19(8):52-54.[3]古元梓,耿薇,郑敏燕,等.微波消解-ICP-OES 法测定肉苁蓉中矿质元素[J].应用化工,2011,40(10):1853-1856.[4]章明,薛德钧.肉苁蓉和锁阳糖类成分含量测定[J].江西中医学院学报,1995,7(1):24-25.[5]孙萍,李艳,杨秀菊.肉苁蓉总黄酮的微波提取及含量测定[J].现代中药研究与实践,2003,17(2):28-29.[6]谭悦,王晓静,陈光静,等.木瓜酒发酵过程中多酚类物质的高效液相色谱测定及含量变化分析[J].食品与发酵工业,2018,44(2):209-216.[7]邹兵,刘玉强,才谦.不同地区锁阳药材及饮片中儿茶素的含量测定[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(6):68-70.[8]裴云逸.花生衣多酚物质HPLC 分析及表儿茶素、儿茶素含量测定[J].食品研究与开发,2018,39(5):141-156.[9]李桦军,朱卓,曹红云,等.一种三七复方提取工艺的研究[J].广州化工,2019,47(14):92-94.
  • 摘要:新型冠状病毒(COVID-19)目前已呈现全球大流行的严峻态势,已对人类政治、经济与学习生活造成巨大影响。随着对COVID-19认知的不断深入,我国已经提出针对性的诊疗方案。肉苁蓉作为一种名贵药材已经具有超过2000年的使用历史,根据学术界已有的研究资料,可以认为中药肉苁蓉具有的润肠通便与免疫调节功能对处于康复期新冠患者具有一定的临床意义。关键词:肉苁蓉; 新型冠状病毒; 康复据世界卫生组织最新统计数据,截止到2020年6月13日,全球累积感染新型冠状病毒的患者已累计740万例,造成约42万人死亡[1]。虽然在我国党和政府的领导下,COVID-19在我国大陆、港澳台地区得到了有效的遏制,但由于其他国家文化与政治体制的差异,导致COVID-19未能在其他国家的得到有效控制,已呈现全球大流行的态势。2020年6月10日,国际顶级期刊《Nature》杂志刊登了关于瑞德西韦(Remdesivir)治疗新型冠状病的的研究报告,报告称在感染早期应用瑞德西韦具有一定的临床意义,但文章作者同时称,由于恒河猴与人类之间的差异,该结果尚有待商榷[2]。与此同时,我国与世界各国都在大力研发针对COVID-19的疫苗,但迄今为止尚未有疫苗上市。据国家中医药管理局报道,采用中西医结合治疗的有效率能达到92%以上,因而可以预见,中药材在COVID-19的防控工作方面具有一定的应用价值与实践意义。Cao等系统的总结了目前中药应用于COVID-19防控方面的进展,认为植物多糖是中药抗击新型冠状病毒的有效成分[3]。国家卫生健康委员会在《新型冠状病毒诊疗方案(试行第六版)》(以下简称方案)中明确了新型冠状病毒感染患者的中医诊疗方案,方案中根据病情发展情况与程度将诊疗方案分为7类,含多种解表类中药[4]。肉苁蓉作为药材使用历史已经超过2000年历史,自东汉《神农本草经》起,各个朝代本草著作均将其作为名贵药材收载。据东汉时期《神农本草经》所载,肉苁蓉“味咸。主治五劳七伤,补中,除茎中寒热痛,养五脏,强阴,益精气,多子,妇人癥瘕(音同争甲)。久服轻身,生山谷。”李时珍在《本草纲目》中记载肉苁蓉“甘、微温、无毒。主治劳伤,精败面黑。”虽方案中肉苁蓉未被列入,但肉苁蓉具有的生理活性使得其仍可考虑作为一种处于康复阶段的患者的备选方案。1 润肠通便方案中明确处在恢复期阶段的患者具有大便无力的症状,而肉苁蓉具有一定的泻下作用。范亚楠等通过盐酸洛哌丁胺制备小鼠便秘模型,同时对模型动物分别施与肉苁蓉总苷、肉苁蓉总多糖、肉苁蓉总寡糖,随后对动物排便情况及小鼠体内各项生理指标进行研究与平行对比发现肉苁蓉总寡糖是肉苁蓉润肠通便的主要活性成分[5]。综合文献报道,结合当前方案中处在康复阶段患者的症状,可以认为,肉苁蓉具有的润肠通便作用有利于患者恢复肠道健康。2 免疫调节针对患者普遍存在的呼吸衰竭的情况,方案认为应当给予机械通气。气管切开插管留置是临床常见的缓解患者呼吸困难的手术之一,也是急救工作中重要的抢救技术,闻国华等认为,气管切开插管留置术在新冠治疗过程中具有一定的必要性[5]。但值得注意的是,该手术不可避免的破坏患者呼吸道的防御功能,进而极易造成患者肺部再次感染,虽然可以使用抗生素对患者病情进行有效控制,但方案中指出,在进行抗菌药物治疗时,应当避免盲目或者不恰当的使用抗菌药物,尤其是联合使用广谱类抗菌药物。姚金茜用肉苁蓉多糖水溶液对气管切开插管留置小鼠给药后发现,相对于对照组,给药组小鼠肺部切片病变呈现明显好转趋势,综合其研究成果,作者认为肉苁蓉能够提高气管切开插管留置患者免疫力,进而对肺部感染产生积极的效果,产生提高免疫力功能的主要成分为肉苁蓉多糖[7]。针对肉苁蓉应用于预防肺部损伤的研究方兴未艾。尹刚等研究发现,肉苁蓉提取物能够有效降低因感染引起的肺部损伤,作者认为,肉苁蓉提取物对剂型肺损伤的保护作用与抑制炎性细胞肺内迁移、促进核酸与蛋白质的合成,同时增强吞噬细胞免疫功能等途径有关[8]。该课题组同时研究了肉苁蓉针对因败血症导致的急性肺损伤的保护作用,研究表明,肉苁蓉同样具有明确的保护作用[8]。此外,多项研究表明,肉苁蓉对因脂多糖致大鼠急性肺损伤、高原肺水肿具有明确的肺部保护作用,不过,毛新民与刘涛认为肉苁蓉预防肺损伤的机制在于其有效成分之一苯乙醇苷类化合物具有的抗炎、抗氧化应激活性[10-11]。Zhao等将肉苁蓉多糖作为疫苗佐剂展开研究,发现肉苁蓉多糖能够提高流感病毒疫苗的体液免疫应答和细胞免疫应答,作者认为,肉苁蓉多糖作为疫苗佐剂具有一定的可行性与安全性[12]。中药活性成分作为疫苗佐剂是中药研究领域的热点之一[13],源于菊粉的多糖佐剂Advax现已开展多项临床试验,涵盖HIV、流感和乙肝等多项病毒性传染性疾病[14]。因此可以认为,肉苁蓉多糖用于COVID-19疫苗的开发具有一定的可行性。3 抗疲劳李永超研究发现肉苁蓉具有明确的抗疲劳作用,其主要活性成分为肉苁蓉中含有的苯乙醇苷类化合物[15]。方案中指明,处在康复期的患者多感倦怠无力,因此,以肉苁蓉作为食疗方案能够缓解这一症状。综上所述,感染新型冠状病毒的患者在康复期临床表现包括气短、倦怠无力、大便无力等症状,而肉苁蓉作为一味名贵药材,已有2000多年的使用历史,根据文献报道,肉苁蓉多糖具有免疫调节、润肠通便等多种生理活性,因此对患者有一定的临床意义。目前,我国首都北京丰台区确诊多例新冠肺炎患者,多与新发地批发市场有关,可以预见,抗击新型冠状病毒将常态化,在日常生活中,不仅要提倡公民讲究卫生,更要做好易感人群的病毒防控工作。肉苁蓉作为一种药食同源的中药,可以在日常生活中适量食用,从而提高个人免疫力,对今后的防疫工作具有一定的意义。参 考 文 献[1] World Health Organization. [DB/OL]. https://www.who.int.[2] Williamson B.N., Feldmann F., Schwarz B., et al. Clinicalbenefit of remdesivir in rhesus macaques infected withSARS-CoV-2. Nature (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2423-5.[3] Peng C, Sanlan W, Tingting W, et al. The important roleof polysaccharides from a traditional Chinese medicine-Lung Cleansing and Detoxifying Decoction against theCOVID-19 pandemic[J]. Carbohydrate Polymers, 240.[4] 国家卫生健康委办公厅. 新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第六版)[EB/OL]. 2020, (2020-02-18).[5] 范亚楠,王佳,贾天柱,等.肉苁蓉不同提取部位对便秘大鼠通便作用的影响[J] .中国医院药学杂志, 2017,37(13):1256-1258.[6] 张彦书, 蔡云辉, 周广全, 等. 新冠肺炎危重型患者气管切开术初步经验与体会(附1例报告)[J].中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志, 2020, 28(02):100-102+92.[7] 姚金茜. 肉苁蓉多糖对气管切开插管留置大鼠肺部免疫功能的影响[D].广西医科大学, 2019.[8] 尹刚, 王志强, 黄美蓉. 肉苁蓉对感染性休克大鼠急性肺损伤的影响[J].中医药学报, 2004(03):62-64+84.[9] 尹刚,王贵林,余万贵.大黄和肉苁蓉提取物对败血症休克模型大鼠肺损伤的影响[ J ] .中国民族民间医药,2009,18(20):11-12.[10] 陶义存, 李建英, 许永华, 等. 肉苁蓉苯乙醇苷对大鼠高原肺水肿的防治作用[ J ] . 中国实验方剂学杂志,2014,20(15):134-138.[11] 由淑萍,汪波,赵军,等.肉苁蓉苯乙醇总苷对脂多糖致大鼠急性肺损伤的抑制作用[J].中国药理学与毒理学杂志,2019, 33(05):347-353.[12] Zhao B, Lian J, Wang D, et al. Evaluation of aqueousextracts of cistanche deserticola as a polysaccharideadjuvant for seasonal influenza vaccine in young adultmice[J]. Elsevier, 2019, 213(C).[13] 朱喆, 蔡泓志, 李映波. 中草药提取物作为疫苗佐剂的研究进展[J].医学研究杂志, 2018, 47(05):7-10.[14] Clinical Trails. [DB/OL].https://www.clinicaltrials.gov/.[15] 李永超. 肉苁蓉有效部位抗疲劳作用机制研究[D].中国协和医科大学, 2007.
  • 筋脉点特指中药材或中药饮片横断面的纤维或维管束。药材折断或切片后,其纤维或维管束呈参差不齐的丝状,犹如人体的筋脉,又称“筋”。在整齐的饮片切面上所表现出的点状痕迹,称之为“筋脉点”。较大的维管束痕迹又称“筋脉纹”。如大黄、何首乌等。
  • 管花肉苁蓉资源丰富、产量大、苯乙醇苷类成分含量高,其寄主柽柳在我国东部盐碱地区分布广泛,为管花肉苁蓉在盐碱地种植提供了条件。研究人员陆续将管花肉苁蓉引种到河北、北京、山东等地,优化栽培技术攻克了东部地区易腐烂的问题[66 - 68]。在这些地区种植管花肉苁蓉面临的主要问题是涝害和冻害导致的腐烂,经过多年的栽培技术研究,通过起垄覆膜、大棚设施栽培、提高土壤孔隙度、降低土壤含水率、改善土壤透气性,有效减少了华北平原因水分含量高、土壤透气性差引起的生长缓慢甚至腐烂的问题[66, 69]。为解决冬季气温低导致的管花肉苁蓉腐烂问题,利用挖保温沟的方法,建立了防控管花肉苁蓉遭受冻害的栽培技术,有效解决了肉苁蓉在东部盐碱地种植不能越冬的问题[70]。种植耐盐作物是有效利用盐碱地的重要途径。柽柳作为盐碱地的先锋植物,在改良盐碱地方面具有很大优势。盐碱地种植柽柳能有效降低土壤全盐含量、疏松土壤、改善土壤肥力,对盐碱地具有显著的生物改良作用[71]。将管花肉苁蓉引入黄河三角洲地区开展人工栽培,管花肉苁蓉能在该地区正常生长、开花、结实,完成其生活史。该地区生产的管花肉苁蓉指标成分松果菊苷和毛蕊花糖苷含量完全符合药典要求[72]。充分利用黄河三角洲地区丰富的柽柳资源,在保护原有盐碱地生态的基础上,发展管花肉苁蓉种植,实现生态效益和经济效益双丰收,为黄河三角洲盐碱地生态高效利用提供了新思路。4 肉苁蓉产品开发与产业发展现状随着人民生活水平的提高,肉苁蓉应用于各种保健品的开发,临床上以肉苁蓉为主药的药物制剂也日益增多。日本将肉苁蓉用于改善和治疗性机能障碍、健忘症、心身疾病等。美国将松果菊苷制成保健品,用来提高人体免疫力。我国新疆地区自古以来有食用肉苁蓉的传统,如民众常用肉苁蓉切片泡酒、添加肉苁蓉粉制作面食等。研制生产出用于补血益肾、抗疲劳功能的保健产品,如帝辰牌康咖片、疆芸牌苁蓉劲片等产品。在药物上则有用于治疗老年痴呆症的苁蓉总苷胶囊或制备中药复方苁蓉精纳米微粉制剂等[73 - 75]。我国已经在临床上用肉苁蓉治疗老年慢性便秘和消除子宫肌瘤。肉苁蓉运动保健饮料正处在动物试验阶段。以松果菊苷为主成分的脑清智明片也获批临床试验[76]。这些新产品的开发将为肉苁蓉打开消费市场创造更多的机会。目前关于肉苁蓉产品的致毒性和安全性评价报道还不多,但仅有的几项研究均证明肉苁蓉可靠的安全性。荒漠肉苁蓉粉做成的一种新型食品喂饲大鼠并进行毒理学评估,没有发现其毒性和不良反应[77]。通过体外和体内试验评估肉苁蓉总苷胶囊Memoregain 的遗传毒性和口服毒性,均未发现明显的不良反应,证明其治疗阿尔茨海默病的有效性和安全性[74, 77]。这些毒理学评估支持肉苁蓉对人类食用的安全性。目前,肉苁蓉作为药食同源物质的申请工作正在进行,有望通过国家卫生健康委员会的药食同源物质的增补。总体来说,市场上肉苁蓉相关产品较少,公众可选择范围较为狭窄,这与日渐充足的药材供给和日益增加的公众需求不符。新疆和田地区自发展人工种植管花肉苁蓉产业以来,产量快速上升,但近几年管花肉苁蓉价格却一路下滑[78],根本原因就是产品选择面太窄,与日益增加的公众需求矛盾。因此,肉苁蓉相关产品的开发、市场的开拓、相关政策的引导,以及中医药科学的发展,都是肉苁蓉产业发展的重要决定因素。5 总结与展望近年来对肉苁蓉的人工种植、化学成分及药理研究都取得了较好的进展,但在药品、保健品、食品等领域中的开发还较为欠缺。对肉苁蓉提取物及各类成分仍需进行更广泛、更深入的药理作用研究,遴选新的生物活性物质,为产品开发提供材料基础和科学支撑; 同时继续开展保健品、功能性食品、化妆品方面的应用研究,进行产品的精深加工,丰富产品种类,开拓下游市场,为肉苁蓉的规模化种植打通产业链。继续加强肉苁蓉的食品和药品安全性研究,阐明肉苁蓉保健品在长期使用下的安全性问题等。肉苁蓉栽培与治沙产业相结合的模式在西部地区获得成功,但在盐碱地利用方面的探索还处于初级阶段。黄河三角洲盐碱地区具有丰富的柽柳资源,尚未得到充分利用。立足保护盐碱地生态环境,营造肉苁蓉柽柳林,创新盐碱地高效生态利用新模式,对黄河三角洲盐碱地综合利用和治理具有重要意义。参考文献:[1] Huang L F,Fu J,Chen S L. 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  • 摘要: 肉苁蓉作为著名的补益中药,具有补肾阳、益精血、润肠通便、抗衰老、提高记忆力、保护神经、保肝等多方面的作用,被称为“沙漠人参”,广泛应用于中医临床处方、中成药和保健产品等方面。本文从功能成分、药理作用、人工栽培及产品开发等方面综述了近年来肉苁蓉的研究进展及产业化现状,可为肉苁蓉的规模化种植、临床应用、产业化开发提供参考,最后讨论了通过在盐碱地上种植肉苁蓉实现盐碱地高效生态利用的潜力和可行性。关键词: 肉苁蓉; 药理作用; 人工栽培; 盐碱地利用; 产品开发肉苁蓉为列当科肉苁蓉属多年寄生性药用植物,具有极高的药用价值,素有“沙漠人参”的美誉。其寄主为护沙先锋植物梭梭、柽柳、盐爪爪等,在干旱的沙漠、戈壁滩、盐碱地均能生存,抗性极强[1]。肉苁蓉主要分布在北非和亚洲国家[2]。在我国,肉苁蓉主要分布于新疆、内蒙古地区,甘肃和宁夏也有分布。《中国植物志》收录列当科肉苁蓉属植物5 个种,包括肉苁蓉( Cistanche deserticola,又称荒漠肉苁蓉) 、管花肉苁蓉( C. tubulosa)、盐生肉苁蓉( C. salsa) 、沙苁蓉( C. sinensis)和兰州肉苁蓉( C. lanzhouensis) [3]。其中,荒漠肉苁蓉和管花肉苁蓉为官方认可作为中药肉苁蓉的基源植物收录入《中国药典》[4,5]。本文对肉苁蓉的功能成分和品种差异、药效研究进展及其人工栽培、产品开发及产业发展状况进行综述,以期为肉苁蓉更系统深入地研究及产品开发提供参考。1 肉苁蓉的功能成分研究及品种差异从20 世纪80 年代开始,国内外学者对肉苁蓉属植物进行了系统的药用成分分离鉴定。迄今为止,已从该属植物中分离出100 多种化合物,包括苯乙醇苷类、苯甲醇苷类、环烯醚萜类、低聚糖和多糖类、木脂素类、单萜类、氨基酸、黄酮类及挥发油类等多种成分,其中多酚类化合物苯乙醇苷类( phenylethanoid glycosides) 含量最高,也是肉苁蓉的主要生物活性成分,包括松果菊苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、2’- 乙酰基洋丁香酚苷和肉苁蓉苷A 等[2,6]。松果菊苷和毛蕊花糖苷通常作为有效成分含量测定的指标性成分[7]。不同品种肉苁蓉化学成分的含量和类型不同。肉苁蓉的紫葳新苷Ⅱ( campneoside Ⅱ) 异构体、肉苁蓉苷A 和肉苁蓉苷C 可作为化学标记物用来区分荒漠肉苁蓉和管花肉苁蓉[8,9]。利用高效液相色谱发现,2- 乙酰丙酮仅存在于荒漠肉苁蓉中,可作为鉴别荒漠肉苁蓉与其它肉苁蓉属植物的潜在化学标志。而花青素A 和类胡萝卜素F是荒漠肉苁蓉和管花肉苁蓉的共同成分。此外,各成分的含量随地理来源的不同而不同,不同生长环境下肉苁蓉的化学成分也有显著差异,例如内蒙古地区的荒漠肉苁蓉中松果菊苷含量明显高于甘肃地区[10]。对盐碱地、草地、沙地三种生态环境中采集的肉苁蓉肉质茎分别进行转录组和代谢组分析,结果表明在盐碱地所产肉苁蓉中苯乙醇苷类成分高于草地和沙地产出的肉苁蓉,2’-乙酰毛蕊花糖苷含量也表现出同样的趋势,表明盐碱地环境有利于肉苁蓉中活性成分的积累[11]。肉苁蓉不同发育时期、不同部位中的活性成分含量也有差异。两年生管花肉苁蓉的多糖含量高于同期一年生,且年内变化趋势基本一致,均在10月份达到最高值[12]。肉苁蓉肉质茎的基部苯乙醇苷类含量最高,越往顶部含量越低,上下差异可达到8 倍以上,而松果菊苷在基部与顶部的含量差异可达22. 4 倍[13]。2 肉苁蓉药用价值研究肉苁蓉的干燥肉质茎入药始载于《神农本草经》,肉苁蓉药材味甘、咸,性温,在传统医学中被广泛应用于治疗肾阳不足、精血亏虚、阳痿不孕、腰膝酸软和肠燥便秘。现代药理研究表明,肉苁蓉及其提取物具有多种生物活性,包括抗炎、抗氧化、提高免疫力、抗衰老、保护神经、提高记忆力、防治骨质疏松、保护心脏、调节血脂、保护肝脏、补肾阳和抗疲劳等多方面作用[14]。国内外学者对肉苁蓉进行了广泛的药理活性研究,发现其活性成分主要为苯乙醇苷、多糖( 低聚糖) 和环烯醚萜类。2. 1 抗炎和抗氧化作用肉苁蓉中的苯乙醇苷类、环烯醚萜类、多糖类均具有抗炎和抗氧化损伤活性。从荒漠肉苁蓉中分离到9 种苯乙醇苷类物质,都具有显著的清除自由基和抗脂质过氧化作用,对大鼠肝微粒体脂质过氧化均有显著的抑制作用,其自由基清除活性比α 生育酚还高[15]。研究表明,毛蕊花糖苷通过降低NO 等炎症因子的释放,抑制炎症相关蛋白的表达,显著降低细菌脂多糖诱导的BV - 2 小胶质细胞神经炎症反应[16]。从荒漠肉苁蓉肉质茎中分离到的一个环烯醚萜类化合物,也能显著抑制BV - 2 小鼠微神经胶质细胞中脂多糖对炎症因子NO 的诱导[17]。肉苁蓉多糖对小鼠小胶质细胞中脂多糖诱导的NO 也有抑制作用,起到抗炎、抗氧化的作用[18]。荒漠肉苁蓉提取物中的低聚糖对雄性大鼠脊髓损伤后的炎症反应、氧化应激和细胞凋亡有明显的抑制作用[19]。因此,肉苁蓉主要通过抑制NO 等炎症因子的释放来起到抗炎的作用。2. 2 提高免疫力及抗衰老作用肉苁蓉中的苯乙醇苷类和多糖均具有显著的增强免疫的作用。给衰老模型小鼠( SAM - P8)喂饲肉苁蓉提取物后,其血液和脾脏细胞中的T细胞和自然杀伤细胞数量显著增加,而外周记忆T 细胞和血清中的促炎性细胞因子IL - 6 明显减少[20]。从荒漠肉苁蓉冷水提取物中分离出的α-( 1→4) -D-葡聚糖和RG - I 多糖,前者对B 细胞增殖有活性,后者对T 细胞和B 细胞增殖均有促进作用[21]。机体的衰老过程包括生理功能弱化和与年龄相关的记忆力降低,与氧化损伤的日益累积、免疫系统的衰退有直接关系。在果蝇成年早期开始喂饲添加管花肉苁蓉的玉米粉提高了果蝇对氧化应激的抵抗力,减缓了衰老引起记忆力降低的进程,有助于延长果蝇的寿命[22]。苯乙醇苷能显著抑制D - 半乳糖致衰老模型小鼠血清、脑SOD 活力的降低,小鼠脾脏系数显著升高[23]。肉苁蓉可通过对抗免疫衰老,显著延长小鼠的寿命。对衰老模型小鼠( SAM - P8) 喂饲肉苁蓉提取物可显著延长小鼠的生存期,且呈剂量依赖性关系[20]。利用D - 半乳糖建立亚急性衰老模型小鼠,分别给药肉苁蓉多糖和管花肉苁蓉麦角甾苷,结果发现两种处理均降低了小鼠组织中的丙二醛含量,淋巴细胞增殖反应、腹腔巨噬细胞吞噬功能和外周血IL - 2 含量明显升高。这些结果说明,肉苁蓉多糖和麦角甾苷能拮抗自由基损伤,增强衰老小鼠心和脑组织端粒酶活性和机体免疫功能[24, 25]。以上结果说明肉苁蓉可通过增强机体抗氧化能力、增强端粒酶活性和提高机体免疫功能而延缓衰老,对降低年老相关疾病的易感性、提高人类寿命具有潜在的利用价值。2. 3 对神经系统的保护及学习记忆能力的改善近年来,肉苁蓉在神经保护、提高记忆力等方面的作用被渐渐挖掘出来。肉苁蓉总苷及毛蕊花糖苷对东莨菪碱所致的小鼠学习记忆障碍均有明显的改善作用[26, 27]。肉苁蓉水煎剂能显著缩短小鼠悬尾试验的不动期,在Morris 水迷宫试验中改善小鼠空间学习记忆能力。肉苁蓉水煎剂处理组的单胺氧化酶活性降低、脑内多巴胺浓度上调,表明肉苁蓉提高了神经兴奋性[28]。肉苁蓉提取物能刺激小鼠脑记忆相关区域中神经生长因子的分泌,促进海马神经元的分化、轴突生长和突触形成,从而显著提高学习记忆能力[29]。管花肉苁蓉醇提取物对缺氧/缺糖再灌注( OGD/R) 所致的PC12 细胞损伤具有较好的保护作用,其潜在机制可能是通过抑制线粒体氧化应激及相关凋亡信号通路实现的[30]。氧化应激是阿尔茨海默症( AD) 的一个重要致病因素。肉苁蓉提取物作为一种抗氧化剂,在治疗阿尔茨海默病中的药理作用成为研究人员关注的热点。苯乙醇苷类物质管花苷B 可以维持线粒体正常的膜电位,降低caspase - 3 活性、减少过氧化氢的毒性作用,抑制神经细胞凋亡[31]。松果菊苷可加快氧自由基的清除能力和降低大鼠脑内氧化应激水平,降低Aβ25 - 35 引起的AD 大鼠的学习与记忆能力的损伤[32]。利用D - 半乳糖和三氯化铝联合诱导小鼠产生类AD 病变,毛蕊花糖苷处可显著增加海马神经元和Nissl 小体,缩短AD 模型小鼠的跳台潜伏期,减少错误次数[33]。进一步研究表明毛蕊花糖苷显著增加了海马中神经生长因子和原霉素受体激酶的基因表达水平,从而减轻D - 半乳糖所致小鼠脑损伤[34]。管花肉苁蓉提取物给药处理可通过阻断淀粉样蛋白沉积、逆转Aβ1 - 42 引起的胆碱能和多巴胺能神经元损伤,改善Aβ1 - 42 诱导AD 大鼠的认知能力[35]。以上结果表明肉苁蓉及其提取物对治疗阿尔茨海默病具有重要意义。2. 4 对骨质疏松的防治作用骨质疏松症是一种以骨质减少和骨微结构退化为特征的代谢性疾病。破骨细胞是降解骨基质的主要效应细胞,其功能异常容易导致骨质疏松症的发生。活性氧积累易导致破骨细胞增殖和分化,在骨质疏松过程中发挥着重要的作用。肉苁蓉多糖通过增强抗氧化酶的表达降低活性氧的产生,抑制破骨细胞分化因子的活性,从而降低破骨细胞分化和骨吸收[36]。使用绝经后雌激素缺乏所致骨质疏松症的啮齿类动物模型进行研究表明,荒漠肉苁蓉提取物显著增加去势大鼠的骨密度,改善骨微结构,骨矿物质含量及血液抗氧化酶活性等有显著的剂量依赖性,表现出显著的抗骨质疏松活性[37]。进一步机理研究发现,肉苁蓉提取物可以抑制RANKL /RANK 诱导的下游NF -κB 和PI3K/AKT 通路的激活,抑制破骨细胞关键生成蛋白NFAT2 和c - Fos 的活性,从而抑制破骨细胞活性[38, 39]。这些结果提示肉苁蓉可以作为治疗女性绝经后骨质疏松症的候选药物。2. 5 对肝脏的保护作用四氯化碳( CCl4) 处理大鼠会产生严重的肝损伤,表现为血清ALT、AST 水平显著升高,ROS和MDA 浓度增加,肝脏SOD 活性和GSH 含量显著降低,病理组织学改变包括肝细胞坏死或凋亡、出血、脂肪变性等[40]。从盐生肉苁蓉中提取的松果菊苷可显著减轻CCl4引起的肝脏损伤,这可能与其抗氧化作用有关[40]。肉苁蓉苷A 对CCl4诱导的肝中毒小鼠也具有保护作用,能改善肝功能的多项指标,如增加自由基清除活性、减轻脂质过氧化损伤、改善线粒体呼吸链功能、减轻脂肪变性和炎性细胞浸润等[41]。肉苁蓉苷A 对酒精引起的肝伤害也有保护作用,其机理是促进细胞凋亡抑制因子基因的表达,抑制早期快速反应基因的表达,提高细胞存活率,从而实现对酒精诱导的小鼠原代培养肝细胞的保护作用[42, 43]。荒漠肉苁蓉的多糖提取物和苯乙醇苷均能改善酒精诱导的肝损伤模型小鼠的血清和肝脏指标的恢复,提高HepG2 细胞的存活,减轻模型动物肝组织中脂肪微泡和坏死细胞,可能是通过影响氧化酶类的活性和丙二醛的形成实现的[44, 45]。这些结果表明,多糖提取物和苯乙醇苷对乙醇诱导的慢性肝损伤具有显著的保护作用。2. 6 对心脏和血管的保护作用肉苁蓉甲醇提取物能提高心肌ATP 的生成能力[46],并能减轻大鼠心肌脑缺血再灌注损伤( I /R) 的影响。经苯乙醇苷类提取物处理的I /R诱导大鼠心肌梗死面积明显减小,由于氧化物清除酶类活性的提高,减轻了再灌注心肌的氧化应激反应,并抑制线粒体介导的凋亡通路,从而对心肌损伤起到保护作用[47]。肉苁蓉提取物具有调节血脂、保护血管的作用。管花肉苁蓉乙醇提取物显著抑制高胆固醇饮食喂养小鼠的血清胆固醇积累。进一步研究发现,毛蕊花糖苷可提高HepG2 肝细胞载脂蛋白B、VLDL 受体和细胞色素P450 SCC 基因的表达,从而影响胆固醇的转运和代谢[48]。2. 7 润肠通便和保护肠道的作用肉苁蓉因富含多糖类具有调理肠道菌群、润肠通便的作用[49]。荒漠肉苁蓉中获得的一种中性多糖CDA - 0. 05 可促进三种对小鼠生长有益的拟杆菌( Bacteroides thetaiotaomicron,B. ovatus和B. fragilis) 的生长,能促进对人体有益的乳酸菌的生长,如干酪乳杆菌( Lactobacillus casei) 、植物乳杆菌( Lactobacillus plantarum) 和罗伊氏乳杆菌( Lactobacillus reuteri) 。因此,CDA - 0. 05 有助于维持肠道内环境的稳定[50]。富含多糖的荒漠肉苁蓉提取物能通过激活免疫系统,减少小鼠的炎症性黏膜增生和肠道内幽门螺杆菌感染,具有预防结直肠癌、肠道炎症的作用[51]。管花肉苁蓉提取物对斑马鱼肠蠕动有促进作用,且呈现浓度依赖性,最高促进率可达23. 26%,可开发成预防或治疗便秘的保健食品或药品等[52]。2. 8 补肾阳和抗疲劳作用肉苁蓉一直作为补肾阳、提高性功能的滋补药材。近代医学研究表明,管花肉苁蓉乙醇提取物可诱导睾丸甾体生成酶的产生,提高大鼠的性激素水平、精子数和精子活力,增强大鼠的生殖能力[53]。荒漠肉苁蓉提取物可使去势大鼠血清黄体生成激素浓度接近正常水平,对去势大鼠的勃起反应及反应潜伏期都有显著的改善作用[54]。羟基脲是具有潜在生殖毒性的一种抗肿瘤药物,同时会引起睾丸衰竭、精子质量下降和血浆激素水平改变等负面作用。荒漠肉苁蓉水煎剂可对羟基脲引起的精原细胞变性有一定的缓解作用,并调节血清性激素水平[55]。荒漠肉苁蓉的苯乙醇苷类提取物能提高ICR小鼠的抗疲劳能力。苯乙醇苷类物质可降低负荷运动后血清肌酸激酶的升高幅度,通过减少肌肉损伤、延缓乳酸积累和改善能量储存提高小鼠的游泳能力[6]。D - 半乳糖处理小鼠可导致小鼠肝组织SOD 及GSH - PX 活性降低,MDA 积累增多。肉苁蓉多糖能降低血清BUN、LA 含量,提高肝糖原、肌糖原含量、提高抗自由基能力,对D -半乳糖致衰老小鼠具有抗疲劳的作用[56]。3 肉苁蓉的人工栽培随着大众对肉苁蓉作为药物和保健品效果的认可,肉苁蓉需求量不断增加,导致野生肉苁蓉的数量迅速减少。20 世纪80 年代起,我国开始了肉苁蓉的人工种植栽培技术研究,并在新疆、内蒙古等地区人工种植获得成功。对肉苁蓉及其寄主植物生长发育特性开展了系统研究,人工寄生技术不断优化,逐步形成了标准化栽培技术和操作规程[57 - 62]。采收一体化作业设备的成功研发,初步解决了机械化采收肉苁蓉的难题。该设备实现了开沟、种植、施肥、覆土一体化,基本取代了人工撒种、种子纸和种子带等种植方式,有效提高了种植和接种效率[62]。尽管该技术还不能完全替代人工采挖的作业方式,但代表了肉苁蓉机械化采挖的发展方向。新疆和田地区、内蒙古阿拉善地区大力发展肉苁蓉产业化,目前已发展为国内管花肉苁蓉和荒漠肉苁蓉的主要种植基地[63, 64]。屠鹏飞团队将肉苁蓉的人工种植与新疆、内蒙古地区治沙相结合,在这方面做了大量的研究和技术推广工作,通过肉苁蓉及其寄主植物的大规模栽培,创造了中国特色的沙漠治理新模式,实现了经济效益、生态效益、社会效益的共赢[65]。
  • 摘要目的:观察肉苁蓉汤治疗便秘的临床疗效。方法:2017-2018 年收治便秘患者61 例,随机分为两组。治疗组采用肉苁蓉汤治疗,对照组服用多潘立酮片治疗。比较两组疗效。结果:治疗组总有效率显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:肉苁蓉汤治疗便秘临床疗效显著,且标本兼治。关键词便秘;中医药疗法;黄元御《四圣心源》肉苁蓉便秘是危害人类健康的常见病之一,据流行病学调查显示,便秘在我国发病率可高达9%~13%,其中25%~30%为老年性便秘。便秘作为一个独立证候,常并发于各种急、慢性疾病过程中。西医多采用对症治疗,而中医药对便秘的治疗有西医无可比拟的优势。资料与方法2017-2018年收治便秘患者61例,随机分为治疗组31例和对照组30例。治疗组男20 例,女11 例,年龄18~90 岁,平均(73±5.6)岁;病程1~40 年。对照组男20例,女10 例,年龄18~90 岁,平均(72±6.3)岁;病程1~40年。两组一般资料比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。中医诊断标准:参照2017 年国家中医药管理局发布的《中医病症诊断疗效标准》评定。⑴中医诊断:①排便时间延长,2 d以上1次,粪便干燥坚硬;②严重者大便艰难,干燥如栗,可伴少腹胀急,神倦乏力,胃纳减退等;③肠道器质性疾病。⑵中医证型诊断标准:脾肾阳虚便秘,表现为大便秘结,面色萎黄无华,时作眩晕、心悸,甚则少腹冷痛,小便清长,畏寒肢冷。舌质淡、苔白润、脉沉迟。纳入标准:①符合2017 年国家中医药管理局颁布的《中医病症诊断疗效标准》; ② 年龄18~90 岁; ③ 血、尿、便、生化常规检查在正常范围内。排除标准:①18 岁以下,90 岁以上;②孕妇;③由药物引起的便秘;④继发于其他疾病的便秘;⑤神经心理障碍导致的便秘。方法:①治疗组给予肉苁蓉汤治疗,方药组成:肉苁蓉20 g,麻仁10 g,茯苓15 g,姜半夏15 g,桂枝10 g,甘草7 g。7剂,水煎服,1剂/d,早中晚分服,7 d为1个疗程,大便正常后再服1个疗程以巩固疗效。②对照组给予多潘立酮片治疗,1 片/次,3次/d,饭前15~30 min口服。观察指标:比较两组临床疗效及不良反应发生率。疗效判定标准:①治愈:大便柔软润滑,排出顺畅,每日或隔日1 次。②显效:大便变软,容易排出,1次/2~3 d。③有效:排便间隔时间缩短,排便困难减轻。④无效:临床症状无改善。统计学方法:数据采用统计学软件分析。计数资料采用[n(%)]表示,χ2检验;P<0.05 为差异有统计学意义。结果两组患者临床疗效比较:治疗组总有效率明显优于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。两组患者不良反应比较:治疗组未见明显不良反应,少数患者因害怕服用中药,但经心理疏导均服用1个疗程以上。典型病例患者,女,76 岁,主诉大便干结状如羊粪5 年,身体无他疾病。曾在多家医院治疗,服用六味安消胶囊、麻子仁丸、大黄苏大片、番泻叶、生大黄、果导片,其疗效时而有效,时而无效。本次再因大便干结状如羊粪而诊,刻下症见颜面痛苦,站卧不安,腹胀,腹痛,舌淡苔白,舌体胖大,舌边齿痕,脉沉。诊断为阴盛肠结型便秘,予以肉苁蓉汤滋肝润肠,以通大便。患者服用7剂后复诊,自述服用3 剂后大便即通,继续服完药物,目前大便通畅,询问是否继续服用,笔者考虑患者年岁已高,便秘5年之久,故再予7剂,后回访大便一直通畅。讨论便秘最早见于《黄帝内经》,称其为“后不利”“大便难”。汉代张仲景则称便秘为“脾约”“闭”“阴结”“阳结”,而到了清代沈金鳌《杂病源流犀烛》才出现“便秘”的名称。便秘是指大便排便周期延长;或周期不长,但粪质干结,排便艰难;或粪质不硬,虽有便意,但便出不畅[1]。其多为饮食不节、情志失调、年老体虚、感受外邪而致大肠传导功能失常。《中医内科学》将其分为实秘、虚秘两大类五型而论治。笔者曾多次试用麻子仁丸、六磨汤、黄芪汤、润肠丸、济川煎、大小承气汤、当归补血汤等方剂治疗,疗效不显著。西医治疗常用多潘立酮、果导片、大黄苏打片,开塞露等治疗,临床近期疗效可,但远期疗效差。笔者翻阅黄元御《四圣心源》发现,黄元御曰:“便坚者,手足阳明之病也[2]。”“伤寒阳明之便结,肠胃之热燥者也;反胃噎膈之便结,胃之寒湿,而肠之寒燥者也。”“以阳主开,阴主阖,阳盛则隧窍开通而便坚,阴盛则关门闭涩而便结。凡粪若羊矢者,皆阴盛而肠结,非关火旺也。盖肾司二便,而传送之职,则在庚金,疏泄之权,则在乙木。阴盛土湿,乙木郁陷,传送之窍既塞,疏泄之令不行。大肠以燥金之府,闭涩不开,是以糟粕零下而不粘联,道路梗阻而不滑利,积日延久,约而为丸。”黄元御将便秘分为阳盛土燥,大便坚硬者而用阿胶麻仁汤;阳衰土湿,粪如羊屎者而用肉苁蓉汤。两型论治,其机理为“金盛木弱”,庚金燥热之气强盛导致大肠经燥涩难行,造成“无水行舟”,乙木衰弱的原因为水寒土湿导致生气萎靡,而木气虚衰导致便秘的特点使粪便呈羊粪状。黄元御用肉苁蓉汤治疗便秘,方中肉苁蓉味甘、咸,性温,功能温肾益精,滋肝润肠;麻仁与肉苁蓉共用,以滑大便;茯苓泻水燥土,分清别浊;甘草培中;桂枝达肝郁;半夏降逆,走阳明。诸药共用使中气恢复健运,大便通泰。肉苁蓉是一种寄生在沙漠树木梭梭根部的寄生植物,素有“沙漠人参”之美誉,是中国传统的名贵中药材,也是历代补肾壮阳类处方中使用频率最高的补益药物之一。湖南已故老中医陈勇说:“中药饮片肉苁蓉假药非常多,如果方药无效,肉苁蓉一定是假药,不必怀疑处方。”探索便秘缘由多为当今社会发展较快,人们因为生活压力节奏加快,疲于工作或生存压力,或生冷冰凉食用过度,或常用空调,高粱厚味,或房劳纵欲等使人体元阳之气过度消耗,而致下焦阳气虚惫,温煦无权,阴寒凝结,不能化气布津。因此临床脾肾阳虚普遍皆是。正如瑞昌九江王能治老先生认为:笔者在数十年临床中所谓的脾约证,因于津亏肠燥者,确实不曾一见。在笔者看来,但凡便秘一证,真正属于热结肠燥的几乎不存在,无一不是脾肾阳虚、虚多实少之证。故使患者保护阳气,尤为重要。黄氏肉苁蓉汤治疗便秘药简效宏,临床观察治疗近期、远期疗效皆好,适用于脾肾阳虚型便秘患者,值得推广。参考文献[1] 张伯礼,薛博瑜.中医内科学[M].北京:人民卫生出版社,2004.[2] 清·黄元御著,孙洽熙校注.四圣心源[M].北京:中国中医药出版社,2009:101-103.

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